SANTRİFUGASYON VE SANTRİFÜJLER
Santrifugasyon bir solüsyon içerisindeki partiküllerin sahip oldukları büyüklük, form ve dansitelerine, medyumun viskozitesi ve rotorun hızına uygun olarak ayrılması tekniğidir. Süspanse durumda olan partiküller ya birbirlerinden ya da içinde bulundukları çözücüden ayrılırlar.
Her bir komponentin sedimentasyon hızı parçacıkların yoğunluğuna (dansite=d), sıvının yoğunluğuna (d sıvı) parçacık formuna, büyüklüğüne ve sıvının viskozitesine bağlı olarak değişir. Partiküllerin sedimentasyon kinetiği kendi dansiteleri ile sıvı medyumun dansitesi arasındaki farkla doğru orantılıdır. Partiküllerin ve medyumun dansitesi birbirine eşit ise sedimentasyon kinetiği 0 dır. Sıvı medyumun dansitesi yüksek ise sedimentasyon kinetiği ters orantılı olarak düşüktür. Santrifüj hızı yükseltilirse partiküllerin sedimentasyon kinetiği artar.
(Kaynak 2) initial: ilk durum , centrifugal force: santrifügal kuvvet, final: son durum
Santrifüjler başlıca analitik ve preparatif amaçlı kullanılır.
Analitik santrifugasyon, sedimente olan partiküllerin sedimentasyon kinetikleri ve moleküler ağırlıkları gibi fiziksel özellikleri ile ilgilenir. Bu işlem için analitik ultrassantrifüjler de geliştirilmiştir. Moleküller santrifugal alanda hareket ederlerken optik sistemler aracılığı ile gözlemlenirler. Bu metotda, rotor dönerken hareket eden moleküllerin resmi, bir filme veya bir bilgisayara yansıtılır. Hücrelerin bulunduğu odacık içerisindeki farklı konsantrasyonlardaki sıvı ortamdan geçen uygun dalga boylarındaki ışığın absorbsiyonu vasıtası ile parçacık davranışları tesbit edilir ve bir yazıcı ya da bir filme aktarılır.
Diğer bir santrifugasyon işlemi preparatif niteliktedir ve spesifik partiküllerin tekrar kullanılmak üzere ayrıştırılmasına hizmet eder. Zonal santrifugasyon, Kinetik santrifugasyon, Differansiyel santrifugasyon ve izopiknik santrifugasyon olmak üzere farklı preparatif metotlar vardır. Bu metotlar daha sonra incelenecektir.
Ultrasantrifugasyon ve düşük hızda santrifugasyon:
Ultrasantrifugasyon işleminde dakikadaki devir sayısı 20 000 den fazladır. Dakikada 10 000 – 20 000 devirli ultrasantrifüjler süper hızlı kabul edilir. Yavaş santrifugasyonda hız, dakikada 10 000 in altındadır.
Centrifugal feld: zantrifugal alan, time : zaman (Kaynak 2)
(Kaynak 4 )
Differansiyel santrifugasyon: En sık kullanılan santrifüj tekniğidir. Santrifugasyonun bu şeklinde bir kısım partikül tüpün dibine çökerken – pelet oluşumu- bir kısmı henüz supernatantda yüzer ve elde edilmesi istenen partiküle göre süpernatant veya pelet tekrar tekrar yıkanarak santrifüj edilir ve partiküller saf halde elde edilmiş olur. Ya da farklı dansitelerdeki partiküller supernatantın farklı bölgelerinde ayrışırlar. Genellikle hücre organellerinin ayrıştırılmasında kullanılan bir yöntemdir. Differansiyal santrifugasyonda sabit açılı rotorların kullanılması tavsiye edilmektedir (Kaynak 4)
Farklı yoğunluklar prensibine göre santrifugasyon (gradienten santrifugasyon): Gradient (yoğunluk farkı) oluşturmak için kullanılan maddeler sakkaroz, gliserin, sezyum klorid, sezyum sülfat, ficoll veya metrizamiddir. Sıvı medyumun yoğunluk farklılığı ya bir karıştırıcı ile önceden oluşturulur ya da santrifugasyon sırasında kendiliğinden oluşur. Sıvı, tüpün dibinde en yoğundur, yukarıya doğru yoğunluğu azalır. Gradyan seçimi amaca göre değişmektedir.
Bu teknik de kendi arasında ikiye ayrılmaktadır.;
Zonal (bölgesel) ve izopiknik (eşit dansite) santrifugasyonu.
Gradyan oluşturma (Kaynak 4) a. Yukarıdan aşağıya doğru b.Aşağıdan yukarıya doğru
Zonal santrifugasyon: İçinde farklı konsantrasyonlarda sıvı bulunan tüpün en üst yüzeyine ince bir tabaka halinde numune tatbik edilir. Dikkat edilecek nokta; medyumun yoğunluğunun, sedimente olacak materyalin minimum yoğunluğundan
Zonal santrifugasyon (Kaynak 4)
Zentrifugalkraft: Santrifugal kuvvet
fazla olmaması gerektiğidir. Santrifugal kuvvet etkisi ile partiküller yukarıda belirtilen özelliklerine bağlı olarak farklı dansitelerdeki solusyonlar içerisinde belli bölgelerde toplanırlar. Bu teknikde santrifugasyon işlemi, partiküller tüpün dibine ulaşmadan bitirilmelidir.
Bu metot, büyüklükleri açısından ayırt edilebilen ancak yoğunluklaı açısından ayırt edilemeyen maddelerin ayrıştırılması için uygundur. Bu tip santrifugasyon için serbest açılı rotorlar tercih edilmektedir ( Kaynak 4)
Bu tip santrifüjlerde tüpler, santrifugasyon sırasında rotorla 90 derece açı yaparlar.
Sample: Numune, Separate according to size and shape: büyüklük ve formlarına göre ayrışma. ( Kaynak 5 )
İzopiknik tip santrifugasyon: Bu tip santrifugasyon yine farklı yoğunluktaki partiküllerin ayrıştırılmasına hizmet eder fakat diğerinden farklı olarak, kullanılacak medyumun yoğunluğu partikülünkinden fazladır. Hem bölge santrifugasyonunda hem de “eşit dansite “ santrifugasyonunda partiküller medyum yoğunluğunun partikül yoğunluğuna uyduğu bölgeye kadar yol alırlar. Daha fazla çökemezler, çünkü artık daha yoğun olan tabaka üzerinde yüzerler. Böylece partikülün dansitesi partikülün ayrıştığı medyum yoğunluğuna göre belirlenmiş olur.
İzopiknik santrifugasyonda, farklı dansitelerde sıvı medyumlar önce bir karıştırıcı düzenekle karıştırılmış durumdadır. Numune de tekrar bu sıvı ile homojen şekilde karıştırılır. Santrifugasyon sırasında partiküller, zamandan bağımsız olarak, kendi dansitelerine uygun dansitedeki solusyon içerisinde yerlerini alırlar. Bu teknikte ama partiküllerin izole edilmesi saatlerce sürer.
Low dansity: Düşük dansite, Medium density: orta dansite, High density: Yüksek dansite. Bu örnekte proteinler kendi izopiknik dansitelerine uygun olarak çökmüşlerdir. ( Kaynak 5 )
Zonal santrifugasyon (Kaynak 4)
Yoğunluklarına göre ayrışan partiküller iki şekilde izole edilir. a. Damlatma usulü ile b. Bir pipet yardımı ile çekilerek
SANTRİFÜJLER
FONKSİYONLARI YÖNÜNDEN:
Analitik santrifüjler: Saflaştırılmış makromolekül ve partiküllerin araştırılmasına; biyolojik makromoleküllerin ya da moleküler yapıların sedimentasyon karakteristikleri, saflıkları, relatif molekül ağırlıkları ve formlarının belirlenmesine hizmet eder. Küçük miktarlarda materyal yeterlidir.
Preparatif santrifüjler: Hücresel elemanların ayrılması, izole edilmesi ve temizlenmesine –saflaştırılması- hizmet eder.
Hemen tüm hücreler, subsellüler organeller, plazma membranları, polizom,ribozom, kromatin,nükleik asit, lipoprotein ve belirli miktarda viruslar bu tip santrifüjlerde ayrıştırılırlar.
DİZAYNLARI VE ÖZELLİKLERİ YÖNÜNDEN:
Santrifüj tipleri (Kaynak 3)
Masa santrifüjleri, Büyük volümlü soğutmalı santrifüjler, Yüksek hızlı soğutmalı santrifüjler, preparatif ve analitik ultrasantrifüjler
Masa santrifüjleri: En basit ve en ucuz santrifüjlerdir. Maya hücreleri, eritrositler, kaba partiküller gibi küçük miktarlarda ve çabuk sedimente olabilen –çökebilen- materyalleri kazanmak için idealdir. Tur sayısı: 4 000-6 000/dakika dır. Maksimum santrifüj kuvveti: 3 000-7 000 g dir. Oda ısısında çalışabilir. Bazılarında serinletme sistemi mevcuttur, bu da proteinleri denatüre olmaktan korumaya yarar.
-Küçük mikrofüjler: Tur sayısı: 8 000-13 000 ve Maksimum santrifüj kuvveti: 10 000 g dir. 250 mm3 ( dl ) – 1,5 cm3 hacimdeki numuneler için uygundur. Materyal 1-2 dakikada çöker. Kan numunelerinin çabuk çöktürülmesinde kullanılır.
Büyük hacimli soğutmalı santrifüjler: - Tur sayısı: 6 000 / dakika ve Maksimum santrifüj kuvveti: 6 500 g dir. Rotorun bulundupu kamara bu tip santrifüjlerde soğutulmaktadır. 10, 50, 100 cm3 hacimli tüpler kullanılabilir. Toplam kapasiteleri 4- 6 dm3 tür. Küçük tüpler, 1-25 dm3 hacimli beher veya şişelerin kullanılmasına izin verir. Yüksek çökme hızına sahip materyallerin izolasyon ve paketlemesinde kullanılır. Örn: Eritrositler, maya hücreleri, hücre çekirdekleri ve kloroplastlar. Santrifüj tüpleri ve içerikleri tam olarak dengeli olmalıdır ve karşılıklı yerleştirilmelidir.
Yüksek hızlı, soğutmalı santrifüjler: - Tur sayısı: 25 000 / dakika ve Maksimum santrifüj kuvveti: 60 000 g dir. Mikroorganizmalar, hücre kümeleri, çok büyük subsellüler organeller veya amonyum sülfatla çöktürülmüş proteinler için kullanılır. Viruslar veya ribozomlar gibi küçük hücre organelleri için uygun değildir.
Santrifüj tipleri (Kaynak 3)
Sıvılı santrifüjler: Bu tip santrifüjlerin özelliği rotorunun içinden sürekli bir sıvının geçmesidir. Bu sıvıda bulunan parçacıklar rotor duvarına sedimente olurlar. Parçacıklardan temizlenmiş olan medyum bir çıkış vasıtasıyla toplanır. Büyük volümlü ( 10- 500 dm3 ) bakteri ve mantar hücrelerinin toplanmasında kullanılır.
Preparatif ultrasantrifüjler: Tur sayısı: 80 000 / dakika ve Maksimum santrifüj kuvveti: 600 000 g dir. Rotor kamarası soğutulur ve hava ile sürtünmeden dolayı ortaya çıkan ısıyı önlemek için rotor kamarası izole edilmiştir. Isı ölçer ve termostat bulunur, maksimum devir sayısının üzerine çıkmasını önleyen sistem ve balans sistemi bulunur. Fakat yine de tüplerin 0.1 gram ağırlık farkına kadar dengelenmiş olması lazımdır.
Preparatif masa santrifüjleri: 6x175 mm3 hacimli tüpler kullanılabilmektedir . Tüpler sürtünmesiz hava yastıkları üzerinde dönerler. Dakikadaki devir sayısı 30 saniye içerisinde 100 000 i bulmaktadır ve maksimum santrifüj kuvveti 160 000 g dir. Steroid hormon reseptörlerinin belirlenmesi, kan plazmasından çoğu lipoproteinlerin ayrılması, fizyolojik sıvılardan proteinlerin uzaklaştırılmasında kullanılmaktadır.
Analitik ultrasantrifüjler: Tur sayısı 70 000 / dakika ve Maksimum santrifüj kuvveti: 500 000 g dir. Dönüş eksenini rotorun kendisinin ayarlama özelliği vardır. Soğutmalıdır. Optik sistemi vardır. Dönme sırasında numunedeki materyalin çökme hızı ölçülebilmektedir.
ROTORLAR
Rotorun boyuna kesiti (Kaynak 4)
Rotorlar bütün mekanik darbelere, kimyasal etkilere karşı dayanıklı olacak şekilde değişik metallerden yapılmaları yanısıra kullanıldıkları alanlara göre sabit açılı rotorlar, vertikal rotorlar, serbest açılı rotorlar mevcuttur, sıvılı rotorlar, elutrasyon rotorları olarak adlandırılırlar. Bunların kullanıldıkları santrifügasyon teknikleri aşağıdaki tabloda özetlenmiştir.
Preparatif rotorlar ve kullanım alanları (Wilson ve Goulding’den)
Rotor Differansiyel sant. Zonal sant. İzopiknik sant.
Serbest açılı - ++ +
Sabit açılı +++ - ++
Vertikal - + +++
Sıvılı +++ - ++
- kötü, + orta, ++ iyi, +++ mükemmel şekilde kullanılabilir.
Rotor tipleri (Wilson ve Goulding’den)
!!!!!!!! BİRKAÇ ÖNEMLİ HATIRLATMA:
-Santrifüj yapılması gerektiğinde dakikadaki devir sayısı, santrifugal kuvvet ( g veya RCF )[ 4 2 x( Dsxdak-1)2xr / 3600x980 formülü ile ifade edilir], kullanılan tüpün rotor merkezine uzaklığı (r ) ve santrifugasyon süresi mutlaka verilmelidir. Dakikadaki devir sayısının, santrifugal kuvvete çevrilmesinde kullanılan tablo aşağıda verilmiştir.
Santrifüjler çok tehlikeli olabileceklerinden çok dikkatli ve itinalı çalışma gerektirir:
-Santrifugasyona başlanmadan önce etrafı kontamine edebilecek materyalleri taşıyan tüplerin ağızları mutlaka çok sıkı kapatılmalıdır,
-Dönmekte olan rotora dokunulmaması gerekir,
-Santrifüj kapağının sıkıca kapandığından emin olunmalı ve rotor tamamen durmadan kesinlikle açılmamalıdır.
Linkback: http://www.gencveteriner.com/index.php?PHPSESSID=87b159f30a5e680625bf5a782834ea36&topic=349.0