HÜCRE KÜLTÜRLERİ
Doku veya organ parçacıklarından
hücreleri enzimler yardımıyla tek tek
ayırarak üretilmesi tekniğine “Hücre
Kültürleri” denir.
Hücreler; stationer veya süspanse kültürler biçiminde üretilirler.
1- Stationer kültürler: Tabakalandırılmış veya monolayer (tek katlı) hücre kültürleridir. Sabit veya döner kültür biçiminde uygulanırlar.
2- Süspanse kültürler: Devamlı hareketli ortamda ve bulundukları kabın yüzeyine yapışmadan canlılıklarını devam ettiren kültürlerdir.
HÜCRE KÜLTÜRÜ TİPLERİ
1- Primer H.K.
Direkt olarak organizmadan alınan taze organ ve dokulardan hücrelerin tek tek ayrılması ve üretilmesiyle elde edilen kültürlerdir.
SUBKÜLTÜR
Primer hücrelerin üretildikleri hücre üretme şişelerinden başka şişelere aktarılarak tekrar üretilmeleri sonucu elde edilen kültürlere “Subkültür” denir.
2. Devamlı ( Permanent) H.K.
Subkültürleri sonsuz olarak yapılabilen ve karyotipleri orijinal olan dokulardan ayrı olarak geliştirilmiş olan kültürlerdir. BHK-21, MDBK, VERO
3. Diploid H.K.
Primer kültürlerin subkültürlerinin yapılmasından elde edilir. Ancak bu kültürler bütün hücrelerin %85 orijinal olan dokunun karyotipine sahiptir.
- Pseudodiploid hücreler
- Heterodiploid hücreler
4. Fibroblast H.K.
Embriyonal dokulardan elde edilen primer hücre kültürleridir.
Hücre Üretme Vasatları
• Eagle’s Minimum Essential Medium
• Dulbecco’s Minimum Essential Medium
+
%10 Fötal Dana Serumu
- Homolog Serum ve Heterolog Serum
* PBS: Phosphate buffered solution
- Hücre yıkama solüsyonu
- Marazi madde nakil solüsyonu
* TRİPSİN: Bağ dokuyu parçalayan enzim.
Primer hücre kültürünün hazırlanmasında kullanılacak organ ve dokuların seçiminde;
• Donörlerin genç olmasına, özellikle fötal dönemde bulunmasına,
• Donörlerin sağlıklı olmasına,
• Organ ve dokularda patolojik lezyonun olmamasına,
• Dondurulmuş organ ve dokuların H.K. için kullanılmamasına,
• Nakil sırasında herhangi bir kimyasal madde kullanılmaması gerekmektedir.
Primer H.K. Hazırlanma Aşamaları;
1- Steril şartlarda, soğuk zincirde dondurulmadan laboratuvara getirilen testisin önce dış yüzü tentürdiyot ile dezenfekte edilir.
2- Epididimis avuç içine gelecek şekilde tutularak steril bir bistüri yardımı ile önce propria vaginalis, sonra tunica albuginea katları açılıp, paranşime inilir.
3- Paranşimden steril bir makas yardımı ile ufak parçalar alınır.
4- Parçalar steril bir petri kutusuna konulup, makas ve çift bistüri yardımı ile daha küçük parçalara bölünür.
5- Steril bir kaşık yardımı ile küçük parçalar erlenmayer içerisine dikkatle taşınır. Bu doku parçaları en az 3-4 defa PBS ile yıkanır.
6- Son yıkamadan sonra erlenmayerdeki parçalar üzerine bağ dokuyu eritme özelliğine sahip % 0.25’lik Tripsin enzimi ilave edilir.
7- Erlenmayer içerisine steril bir manyetik çubuk atılarak oda sıcaklığında hücreler manyetik karıştırıcıda 15-20 dakika karıştırılır. Bu sıvıda, ölü hücreler, spermatozoonlar ve kan hücreleri bulunacağından dışarı atılır. Bu işleme “Ön Tripsinizasyon” denir.
TRİPSİNİZASYON
1- Sıcak Tripsinizasyon
37°C’de 15-20 dakika aralıklarla yapılan tripsinizasyon.
2- Soğuk Tripsinizasyon
+4°C’de 1 gece boyunca yapılan tripsinizasyon.
8- Tekrar bu dokuların üzerine % 0.25’lik tripsin konulur ve tripsinizasyon tekrarlanır. 15-20 dakika karıştırılır. Süre sonunda ağzına steril tülbent gerilmiş steril beher glastan tripsin-hücre karışımı süzülür ve +4°C’de saklanır.
*Bu tripsinizasyonlar tüm dokular ortadan kalkıncaya kadar tekrarlanır.
9- Tülbentli beher glasta toplanan tripsin+hücre karışımı santrifüj tüplerine konularak +4°C’de 1000 devirde 10 dakika santrifüj edilip, hücrelerin tripsinden ayrılması sağlanır.
10- Santrifüj tüpünün dibine toplanan hücrelerin yüzeyinde az miktarda da olsa tripsin bulunabileceğinden hücreler üzerine PBS konulup yeniden iyice süspanse edilip, tekrar aynı şartlarda santrifüj edilir.
11- Santrifüj tüpünün üst kısmındaki PBS dökülür. Çöken hücrelerin üzerine mililitresinde 50.000-300.000 hücre bulunacak şekilde hücre üretme vasatı ilave edilerek hücre süspansiyonu elde edilir. Bu süspansiyon doku kültürü tüpleri veya şişelerine konularak 37°C’lik etüvlere üremeye bırakılırlar.
12- 48 saat sonra hücre üretme vasatı dökülerek yerine yeni HÜV ilave edilip 37°C’lik etüvlere yeniden kaldırılır. Hergün doku kültürü mikroskobunda kontrol edilir.
Linkback: http://www.gencveteriner.com/index.php?PHPSESSID=0c5ac9921ad3a76c96e14a53d473c330&topic=185.0