HEMAGLÜTİNASYON İNHİBİSYON (Hİ) TESİ
Hemaglütinasyon inhibisyon (Hİ) testi, serolojik bir özellik taşır ve kanda antikor varlığını ve antikorun miktarını saptamada kullanılır. Test makro ve mikro Hİ testi şeklinde genellikle tüplerde veya mikropleytler yapılır.
Hİ testinin esası kısaca şöyledir. Hastalıktan şüpheli bireylerden alınan serumlar, eğre virusa karşı spesifik antikorlar taşıyorlarsa, bu antikorlar virusla temasla, virusun HA özelliğine nötralize ederek HA’ya mani olurlar. Türlerde, dipte, yuvarlak nokta şeklinde (düğme) alyuvar birikintisi olur. Eğer serumda antikor yoksa, virus nötralize olmayacağından, HA kabiliyeti korunacak ve alyuvarları dantela şeklinde kümeleştirecektir. Tüplerin dibinde dantela görünümü oluşacaktır. HI testi değerlendirme bakımından HA’nın tersi bir durum gösterir. Yani HA varsa kanda antikor yok, HA yoksa kanda antikor var demektir.
Hemaglütinasyon İnhibisyon (Hİ) Serum Dilisyonları (iki katlı)
1. Serumlar (şüpheli) iki katlı sulandırılır (1/2, ¼, 1/8—>),
2. Virus 4 (veya
HA ünitesinde sabit tutulur, virusun HA titresi 1/64 olduğundan ve bu dilasyonda virusun 0,25 ml miktarında 1 HAÜ vardır. Buna göre, virusun 1/16 dilasyonunun 0,25 ml 4 HAÜ bulunur. Virus 1/16 sulandırılarak her tüpe bu dilasyondan 0,25 ml ilave edilir.
3. Alyuvar süspansiyonu ( %1 veya %0,5) oranında hazırlanır.
Önce serumlar iki katlı sulandırılarak her sulandırmadan ayrı tüplere 0,25 ml konur. Üzerine 4 (veya
HA ünitesinden sabit tutulan virus sulandırmasından aynı tüplere 0,25 ml ilave edilir. İyice karıştırılır, oda ısısında 20 dk bekletilir. Sonra üzerine %1’lik alyuvar susupansiyonlarından 0,25 ml ilave edilerek karıştırılır. Oda ısısında 45–60 dk tutulur. Sonuçlar yukarıda açıklandığı tarzda değerlendirilir. Ancak, sonuçları değerlendirmede, inhibisyon görülen son tüpe ait serum dilusyonu, 4HA ünitesi ile çarpılarak serumun inhibisyon titresi bulunur yani inhibisyon noktası 1/64 ise serum inhibisyon titresi 4x1/64=1/256, log2 1/256 (2-8) olarak kabul edilir. Virusun 4 (veya
HA ünitesinde sabit tutmada bazı hatalar yapıldığında geri titrasyon yapmak ve sabit üniteyi kontrol etmek gerekir. Geri titrasyon, teste tabi tutularak kullanılan virusun istenilen HA ünitesinde yani 0,25 ml de 4 HA ünitesinde olup olmadığını belirler.
Hİ testi, sadece infeksiyona yakalanmış veya kanlarında antikor bulunana veya yakalanmamış (antikor taşımayan) bireyleri değil, aynı zamanda aşılama sonu oluşan bağışıklığın durumunu belirlemede de işe yarar.
Hİ testinde yararlanılarak, insan veya ahyvan topluluklarında (populasyon) aşılamadan sonra oluşan antikorların durumu belirlenerek bağışıklığın ne düzeyde olduğu saptanabilir.
Hİ Testinde Dikkat Edilecek Noktalar
1. Test, oda ısısında yapılmalı ve değerlendirilmelidir.
2. Test yapılmadan hemen önce virusun HA titresi yeniden saptanmalı ve HA ünitesi iyi belirlenmelidir.
3. Virus, bu yeni titreye göre 4 Hİ ünitesinde (veya 8 HA ünitesinde) sabit tutulmalıdır. Örneğin; virusun HA titresi 1/64 ise, 4 HA ünitesi 64/4=1/16 eder. Yani, virus 1/16 sulandırıldığında bir inokulum miktarında (0,25 ml) 4 HA ünitesi bulunacak demektir.
4. Virus ve alyuvar stok süspansiyonları kullanılmadan önce homojen olarak ve iyice karıştırılmalıdır.
5. Serum çok dikkatli olarak sulandırılmalı ve kabul edilen metoda göre iki katlı yapılmalı (1/2, ¼, 1/8, 1/16)
6. Sonuçlar 45–60 dk. İçinde okunmalıdır.
7. Negatiflik kriteri: Sonuç da, serumların pozitif veya negatif olduğuna karar verirken, daha önceden bir negatiflik kriteri belirlenerek bunun üstündeki değerleri pozitif ve altındaki değerleri negatif olarak kabul etmek daha uygun olur. Hatta şüpheli serumları ortaya koyabilecek bir ara kriteri de saptanmalıdır. Böylece, sonuç negatif, şüpheli ve pozitif olarak üç kategoride değerlendirilebilir.
8. Negatiflik kriteri belirlenirken hiçbir hastalık geçirmemiş veya aşılanmamış bireylere ait en az 15–20 serumun titresi saptanarak karar verilir.
9. Geri titrasyon: Ne kadar dikkatli çalışılsa bile, 4Hİ ünitesine göre virusu sulandırmada (veya sabit tutmada) çok defa hata yapılmakta ve bir inokulum içinde 4 yerine, 4’ten az (<4) ünite isabet etmekte ve buda Hİ sonuçlarını etkilemektedir. Bunu saptamak için 4HA ünitesinde (1/16) sabit tutulan stok virus süspansiyonu bu defa 1/16’dan başlamak üzere, ayrı bir seri tüpte (veya pleyt’te) 1/16, 1/32, 1/64, 1/128’e kadar devam eden bir HA titresi belirlenmesi yapılır. Eğer hemaglütinasyon 1/16 (+), 1/32 (+) ve 1/64 (+)’e kadar pozitif ise o zaman Hİ titresinde kullanılan 4 HA ünitesi de doğru olur. Eğer titre 1/32’de kalmışsa, o zaman stok virus süspansiyonu bir inokulumunda da yani 0,25 ml de 4 HA ünitesi yerine 2 HA ünitesi bulunmaktadır. Sonuçların değerlendirilmesi 2HA ünitesine göre yapılır.
Böyle durumlarla karşılaşmamak için Hİ testinden hemen önce HA titresini iyi tayin etmeli ve sabit tutulacak virus dilisyonunu da çok dikkatli hazırlanmalıdır.
10. Kontroller: Denemede birer tüp (pleyt çukuru) olmak üzere, fizyolojik su, negatif ve pozitif serum kontrolleri konulur.
11. Bazı hatalıklarda Hİ testi uygulanırken serumlar pariodat ile muamele edilir.
12. Sulandırmaların kesin-doğru olmaması ve serumlar, sulandırılırken, bir sonraki tüplere fazla antikor transferleri önemli yanlışlıklar meydana getirirler.
Linkback: http://www.gencveteriner.com/index.php?PHPSESSID=ff16f625e95be4475603ed76950f4ca7&topic=575.msg4917