Virus izolasyonu için laboratuvara gönderilen materyaller doku kültürlerine ekilmeden önce bazı işlemlere tabi tutulması gerekir. Doku kültürlerine ekime hazır hale getirilen marazi maddelere “İnokulum” denir.
KANDAN İNOKULUM HAZIRLANMASI
1- Kan, antikoagulanlı madde (EDTA, sodyum sitrat) içeren tüplere alınır.
2- +4 °C’de 1000 devirde 10 dakika santrifüj edilir. Santrifüj sonunda tüpün en alt tabakasında eritrositler, eritrositlerin hemen üstünde beyaz bulutumsu tabaka olarak lökositler ve en üstte plazma sıvısı yeralır.
3- Bir pastör pipeti yardımıyla plazma tabakası geçilerek lökositler alınır ve 2 ml PBS içeren bir tüpe aktarılarak tekrar +4 °C’de 1000 devirde 10 dakika santrifüj edilir. Bu işleme “Lökositin Yıkanması” denir.
4- Bu işlem 2-3 kez yapılmak suretiyle başlanğıçta lökositlerle beraber toplanan eritrosit ve plazma tamamen lökosit süspansiyonundan uzaklaştırılır.
5- Son yıkamadan sonra lökositler 1 ml HÜV içine aktarılır ve hücre kültürlerine inokulasyon amacıyla kullanılır.
6- H.K.’ne hemen ekim yapılmayacaksa, süspansiyon hacminin %10’u oranında DMSO eklenerek kademeli olarak lökosit süspansiyonu dondurulur.
SEROLOJİK TESTLERDE KULLANILACAK SERUMUN HAZIRLANMASI
1- Bu amaçla boş cam tüplere veya kaolin, silikon gibi koagule edici maddeler içeren tüplere kan alınır.
2- Pıhtılaşan kan bir tel ile çizilerek pıhtının tüp çeperinden ayrılması sağlanır.
3- +4 °C’de 1 gece veya oda ısısında birkaç saat bekletilerek serumun tüpün çeperi ve pıhtı arasındaki boşluğa toplanması sağlanır.
4- Serumun daha iyi çıkması için gerekirse kan 3000 devirde 10 dakika santrifüj edilir.
5- Serum bir tüpe alınır ve +56°C’deki su banyosunda 30 dakika süre ile inaktive edildikten sonra serolojik testlerde antikor tespiti amacıyla kullanılır.
GAİTADAN MARAZİ MADDE HAZIRLANMASI
1- Laboratuvara getirilen gaita numuneleri 10xantibiyotikli PBS içerisine 1/10 oranında karıştırılıp havan ile homojenize edilir.
2- Ağzına steril gazlı bez bağlanmış bir beher glastan süzülerek kaba partiküllerinden arındırılır ve süzüntü santrifüj tüplerine aktarılır.
3- 20-30 dakika +4°C’de 2000-3000 devirde santrifüj edilir.
4- Üstteki sıvıdan 2 ml alınarak içerisine bu miktarın %10’u oranında konsantre antibiyotik ilave edilir. Antibiyotiğin etkimesi için +4°C’de 1 saat bekletilir. Bu elde edilen sıvıya inokulum denir.
5- İnkubasyon sonunda inokulumdan bir miktar alınıp agara ekim yapılarak sterilite kontrolüne alınır ve agar 37°C’lik etüvde 48 saat bekletilerek değerlendirilir. Ekimi yapılan inokulum -80°C’lik derin donduruculara kaldırılıp sterilite kontrolü sonucuna göre değerlendirilir.
NAZAL-KONJUKTİVAL-GENİTAL SWAP
1- Steril swaplar yardımıyla marazi madde alınır.
2- 3-4 ml 10xantibiyotikli PBS içerisine swap konulur ve laboratuvara gönderilir.
3- Laboratuvara gelen swap önce vortekslenir ve daha sonra swap çubuğu ucundan bir pensle tutularak swap tüp çeperine iyice sıkılarak marazi maddenin PBS’e geçmesi sağlanır.
4- Tüp içeriği 2000-3000 devirde +4°C’de 10 dakika santrifüj edilir.
5- Santrifüj sonrası üstteki sıvıdan 2 ml alınıp içine bu miktarın %10’u oranında konsantre antibiyotik ilave edilip, +4°C’de antibiyotiğin etkimesi için 1 saat beklenir. Bu sıvıya inokulum denir.
6- İnkubasyon sonunda inokulumdan bir miktar alınıp agara ekim yapılarak sterilite kontrolüne alınır ve agar 37°C’lik etüvde 48 saat bekletilerek değerlendirilir. Ekimi yapılan inokulum -80°C’lik derin donduruculara kaldırılıp sterilite kontrolü sonucuna göre değerlendirilir.
HÜCRE KÜLTÜRLERİNİN VİRUS EKİMİNE HAZIRLANMASI
Bir hücre kültürüne ekim yapılabilmesi için, hücre kültürü şişesinin yüzeyi tamamen veya en az %80 oranında hücrelerle kaplanmış olmalıdır. Ekimden önce hücre kültürlerinin mikroskobik kontrolleri yapılarak, hücrelerin formları ve kontamine olup olmadığı incelenir.
HÜCRE KÜLTÜRLERİNE EKİM METOTLARI
1- Adsorbsiyona bağlı Virus/İnokulum ekim metodu
Virusun hücreye kolay adsorbe olmasının sağlanması esasına dayanan bir metottur.
* H.K.’de zayıf üreyen virus türleri veya enfeksiyözite gücü düşük viruslar için bu yöntem kullanılır.
2. Adsorbsiyona bağlı olmayan Virus/İnokulum ekim metodu
Yüksek enfeksiyozite gücüne sahip viruslar ile H.K’ne iyi adapte olmuş viruslar bu yöntemle üretilirler.
3. Parvoviruslar gibi bazı viruslarda hücre içine girmesinin kolaylaştırılması amacıyla hücre süspansiyonu ile birlikte ekilirler.
HÜCRE KÜLTÜRLERİNDE VİRUS ÜREMESİNİN SAPTANMASI
Viruslar, hücre kültürlerinde üreme durumlarına göre 3 gruba ayrılırlar;
1- Sitopatojen viruslar
2- Proliferatif viruslar
3- Hücresel bozukluk yapmadan çoğalan viruslar (ncp)
SİTOPATOJEN VİRUSLAR
1- Hücre erimesi (Lizis)
2- Hücrelerin yuvarlaklaşması
3- Granüllü dejenerasyon
4- Hücre füzyonu
5- Sinsityum ve dev hücresi oluşumu
6- İnklüzyon cisimcikleri
7- Vakuollü dejenerasyon….
PROLİFERATİF VİRUSLAR
Hücrelerin üst üste tabakalar halinde yaygın biçimde
çoğalmasına hücre proliferasyonu denir. Hücrelere
viruslardan ileri gelen proliferasyona “proliferatif etki”
denir.
2 farklı şekilde oluşur;
1- Tümör oluşturmayan viruslarda (Variola virus)
2- Tümör oluşturan viruslarda (Polyomaviruslar)
Hücresel Bozukluk Yapmadan Çoğalan Viruslar
Bu viruslar non-sitopatojen viruslar olarak ta adlandırılır. Sığırların VD-MD ve bazı influenza viruslar bu grupta yer alır.
Bu viruslar 5 teknikle tespit edilebilir;
1- Hemadsorbsiyon testi
2- İmmunfloresan testi
3- İmmunperoksidaz testi
4- İnterferens fenomeni
5- Elektron mikroskopi