Besiyerleri

[barbaros_66]

                    KÜLTÜR                                       
Gönderilen muayene maddelerinden, araştırılması istenen hastalık yönünden, normal veya özel katı ve sıvı besi yerlerine ekimler yapılır. Kültürler optimal ısı derecesinde ve araştırılan hastalık etkeninin karakterine göre, aerobik, mikroaerofilik veya anaerobik koşullarda uygun bir süre inkubasyonda bırakılır.Besi yerleri (vasat = media = besi ortamı = kültür ortamı) mikroorganizmaların gelişmesine uygun ortamlardır.

a) Katı ortamlarda üreme şekilleri:

Bakteriler uygun bileşimdeki veya zenginleştirilmiş (%8 kan+%0.1 glikoz +%0.1 yeast ekstrakt veya diğer maddelerle) katI besi yerlerinde, uygun bir inkubasyon sıcaklığı ve süresinden sonra gözle görülebilecek büyüklükte koloniler meydana getirirler. Bakteriler arasında yer almasına karşın, rickettsia ve Chlamydia'lar cansız ortamlarda üreyemezler. Bunları üretmede deneme hayvanları veya doku kültürleri kullanılır.
Bakterilerin katı ortamlarda oluşturdukları kolonilerin büyüklüğü, morfolojik ve yapısal özellikleri ayrıntılı olarak incelenir. Göz ve stereoskopik mikroskopla yapılan muayenelerde kolonilerin S,R,M,L formları, rengi, kokusu, homoliz durumları ve diğer morfolojik özellikleri ayrıntılı olarak gözlenir ve belirlenir.Bazı bakteriler aerobik koşulları, diğerleri ise anaerobik veya mikroaerofilik ortamları sever.
Bazı bakteriler 18-24 saatte (E. coli, Pseudomonas, Aeromonas, vs.), bir bölümü 2 günde; streptokok, korinebakteri brusellalar, 4-5 günde; Mycoplasma, 6-10 günde; veya mikobakterilerde olduğu gibi 20-30 günde gözle görülebilir koloniler oluştururlar. Katı besi yerinde oluşan koloniler ne kadar seyrekse o kadar fazla gelişirler. Buna bağlı olarak da koloni çapı büyür.
Mezofilik bakterilerin üremesi 35-38 oC dereceler arasında iyi olmasına karşın balık patojen'leri (psikrofilik'ler) genellikle 20-25 oC arasındadır.
Aerobik mikroorganizmalar normal atmosferdeki O2 'de, anaerobikler oksijensiz ve mikroaerofilikler ise %10 CO2 'li ortamlarda daha iyi ürerler. Fakültatifler ve aerotolerantlar ise her koşulda üreme gösterebilirler. Katı besi yerlerinde hastalık etkenini üretmek ve izole etmek için, ekim veya özel yayma teknikleri kullanılmalı ve mümkün olduğu kadar mikroorganizma tek olarak düşürülmelidir. Katı veya sıvı besi yerlerine, genellikle, lezyonların bulunduğu yerden ve kenarlarından alınan maddeler ekilirler.

b) Sıvı ortamda üreme özellikleri:

Uygun sıvı besi yerlerinde bakteriler, belli bir süre sonra, bol, zayıf veya orta derecede bir üreme yeteneğine sahiptirler. Bazıları üstte pellikül, dipte tortu, saç gibi, veya granüllü bir üreme gösterirler. Üremenin türleri besi yerinin bileşimi, inkubasyon sıcaklığı ve süresine bağlı olduğu gibi, o türün genetik bir karakteridir. Besi yerine katılan bazı maddeler (pepton, serum, kan, glikoz, maya ekstraktı ve diğer bazı maddeler de üreme üzerine olumlu yönde etkiye sahiptirler.

Besi yerlerinin kullanım amaçlarına göre sınıflandırılmalarında da farklı yaklaşımlar vardır. Bir kısım araştırıcıya göre belirli bir grupta yer alan bir besi yeri bir diğer kısmına göre ise başka bir grupta sınıflandırılmaktadır.Balık patojen bakterilerinin neredeyse tamamı aerobik mikroorganizmalardır. Bunun için genel olarak aşağıda verilen ortamlar kullanılır;










1-Canlı Ortamlar
       a.Deney Hayvanları
       b.Canlı Doku
2-Cansız Besiyerleri
         2.1.Genel Besiyerleri (Trypticase Soya Agar   (TSA), Beyin-Kalp İnfüzyon Agar (BHIA))
         2.2.Özel Besiyerleri
                a) Selektif Besiyerleri
                b) Diferansiyel Besiyerleri
                c) Zenginleştirilmiş Besiyerleri
                d) İdentifikasyon Besiyerleri
                e) Diğer Besiyeri Çeşitleri
Tatlı su balıklarından elde edilen bakteriler 20-23°C’lerde, deniz balıklarında ise 25-28°C’lerde inkübe edilmelidirler.

           Canlı Ortamlar
   
        Canlı ortamlar deyiminden canlı ve çoğalan hücrelerin bulunduğu ortamlar anlaşılır. Bu nitelikteki başlıca canlı ortamlar şunlardır:

a) Deney Hayvanları;

Üretilmek istenilen mikroorganizmaların tür ve özelliklerine göre seçilmek üzere laboratuar uygulamalarında pek çok tür hayvanlar deney için kullanılabilir. Bunlar arasında her gün kullanılmakta olan kobay, fare, sıçan, tavşan, hamster ve kümes hayvanlarından başka maymun ve diğer çeşitli hayvanlar yer alır. Yine aynı nedenlere bağlı olarak bu hayvanlar arasında bir türün belli yaş (örneğin; yeni doğan vb.) cinsiyet ve ağırlıktakilerin kullanılması gerekebilir. Örneğin Coxsackie virüslerinin üretilmesi için yeni doğmuş farelerin kullanılması gerekli olduğu halde Leptospiraların incelenmesinde kullanılacak kobayların yaşı önem taşımaz. Yine incelenecek olan mikroorganizmaların türüne ve inceleme maddesinin cinsine göre deney hayvanına aşılama (inokülasyon) yeri ve yöntemi değişik olur.
Deney hayvanları içerisinde döletli yumurtanın ayrı ve önemli bir yeri vardır. Özellikle bu ortamda üreyebilen virüsler (İnfluenza, kabakulak, herbes vb) ve rikettsia’lar için çok önemli bir ortamdır. Üretilecek mikroorganizmaların türüne göre embriyolu yumurtanın sarı kesesine, embriyosuna, koryoallantoik veya amniyotik zarlara ve bu isimli boşluklara aşılamalar yapılabilir.

b) Doku Kültürleri;

           Tüp, şişe, petri kutusu v.b. gibi laboratuar kablarında uygun besleyici sıvıların içerisinde üretilerek kullanılan canlı dokulardır. Bu amaçla çeşitli canlıların (insan, maymun, tavşan, kobay, fare, tavuk embriyonu v.b.) çeşitli organları (böbrek, akciğer, tümör, amniyon zarları v.b.) önce parçalanarak canlı hücreler tek tek veya en çok birkaç hücrelik gruplar kalacak şekilde ayrıştırırlar. Hücreler belirli sayıda olmak üzere içlerinde çeşitli tuzlar, aminoasitler, vitaminler ve çoğu kez dana ya da at serumu içeren besleyici sıvılarda süspanse edilerek steril ve nötral laboratuvar ya da şişelere konurlar. Bu hücre süspansiyonları 36-37 ºC’de bekletildiğinde hücreler kabın çeperine yapışarak ürerler. Özellikle virüsler ve riketsiya gibi mikroorganizmalar bu ortamlarda üretilirler.
          Ricketsiales takımı içinde Ricketsia cinsi mikroorganizmaları kesin olarak hücre içinde ve stoplasmada, bazen nükleusta üremekte, hücre vakuollerinde üreme gösterememektedir. Coxiella cinsi olarak ayrılan aynı takımdaki mkroorganizmalar zorunlu olarak canlı hücre içinde üremeğe alışmış olup, hücre dışı (invitro) ortamda üretilememişlerdir. Ancak hücre içinde stoplazmadan çok vakuollerde üreme alışkanlığında olmaları nedeniyle bunların bir cansız ortamda da üretilebilme şansı vardır.






Cansız Besiyerleri

1. Genel Besiyerleri

          Herhangi bir inhibitör madde içermeyen, besin maddelerince yeterli veya zengin, herhangi bir mikroorganizma grubunun gelişmesini özel olarak desteklemeyen, bazı zor gelişen (fastidious) mikroorganizmaların da dahil olduğu çok sayıda bakterinin gelişmesini sağlayan besiyerleridir.
Genel besiyerleri başlıca, çeşitli örneklerdeki toplam mezofil aerob bakteri sayımı, toplam psikrofil aerob bakteri sayımı, bozulma/hastalık etmeninin ön izolasyonu amaçları ile kullanılır.Nedeni hakkında bir ön fikir edinilemeyen hastalık etmeninin izolasyonu için genel besiyeri kullanılır.
Genel besiyeri tarifi mikrobiyolojinin farklı disiplinlerine göre değişiklik gösterir. Gıda mikrobiyolojisi açısından mezofil aerob bakterilerin sayılabileceği Plate Count Agar, CASO (Tryptic Soy) Agar, Nutrient Agar genel besi yeri örnekleri iken klinik ve veteriner mikrobiyolojide Kanlı (Blood) Agar genel besiyer olarak kabul edilmektedir.Tüm bakterilerin geliştirilebileceği nitelikte bir genel besi yeri yoktur. İnkübasyon koşullarının değiştirilmesi ile psikrofillerin, mikroaerofillerin, aerotolerantların ve özel inkübasyon koşullarının sağlanması ile kısmen anaerobların geliştirilmesinde kullanılır.
          Temel sıvı besi yeri Pasteur buyyon’dur. Bu vasatın uygun olduğu haller bakterilerin bol miktarda üremelerini sağlar. Üreme şu şekillerde kendini belli eder;
• Yaygın bulanıklık, çalkalandığında hafif bulutlanma teşekkül eder ve aynı zamanda renk meydana gelir (pseudomonas pyoctana).
• Dipte tortu teşekkülü; Bakteri kitleleri pamuk yumakcığı şeklinde kümeler yapar, çalkalandığı zaman pamuk gibi yukarı doğru kalkar (Anthrax basilleri, Streptokoklar)
• Yüzeyde zar teşekkülü; Sıvı besi yerleri üzerinde meydana gelen yüzey zarı aerop bakteri çeşitlerinde meydana gelir.
Üremenin kuvvetlendirilmesi için protein seven (Serophile) bakteriler için serum, kan, ascites, Gliserin seven (Glycerinophil) bakteriler (Corinebacter mallei) için gliserin ilave edilir.

2. Özel Besiyerleri

          Bir tarife göre genel besiyerleri dışında kalan tüm besiyerleri "özel besiyerleri" grubuna girer.

a) Selektif Besiyerleri;

          Selektif besiyerleri, karışık bir mikrobiyel floradan gelişmesi istenmeyenleri baskılamak ve inhibe etmek, ancak gelişmesi istenenler için herhangi bir olumsuz etki yapmamak üzere formülize edilirler. Bu amaçla çeşitli inhibitör maddeler kullanılır.Selektif besiyerleri, belirli bir grup hatta yüksek selektivite gösterenlerde tek bir cins/ tür mikroorganizmanın gelişmesine izin vereceğinden bu besiyerleri selektif izolasyon, selektif sayım ve hatta ön identifikasyon amaçları ile kullanılır.
            Bir besiyerine selektivite kazandırılması her zaman inhibitör madde ilavesi ile yapılmaz. Geliştirilmesi istenilen mikroorganizmanın kullanabileceği, ancak refakatçi mikroflora tarafından kullanılamayan besin maddeleri besiyerine karbon ve azot kaynağı olarak verilerek selektivite sağlanabilir. Örneğin GSP Agar (Merck) besiyerinde glutamat ve nişastadan başka besin maddeleri yoktur. Nişasta ve glutamat Pseudomonas ve Aeromonas türleri tarafından besin maddesi olarak kullanılırken gıda maddeleri, atık sular ve gıda endüstrisi ekipmanında bu bakteriler ile birlikte bulunan bakteriler (=refakatçi mikroflora) bu maddeleri metabolize edemez ve dolayısıylagelişemez

b) Diferansiyel Besiyerleri;
           Selektif besiyeri hazırlamak ve kullanmak; inhibitörlerin gelişmesi istenen mikroorganizmaya az da olsa bir miktar zarar verebilmesi, inhibitör kullanımı ile istenmeyen mikroorganizmaların inhibisyonun her zaman mümkün olmaması, bazı inhibitörlerin insan sağlığı için de zararlı olması vb nedenlerle her zaman istenilen sonucu vermemektedir.
            Diferansiyel besiyerlerinde gelişmesi istenen mikroorganizma yanında diğer mikroorganizmalar da gelişebilir, ancak başta koloni morfolojisi olmak üzere çeşitli farklılıklar ile hedef mikroorganizma diğerlerinden ayrılır.Bu tarif altında diferansiyel besiyerleri zayıf ve orta güçte selektivite gösteren selektif besiyerlerinin modifikasyonu olarak nitelendirilebilir.
            Ayırt edici (fark ettirici) koloni özelliği, çeşitli pH indikatörleri, boya maddeleri, indirgeyiciler, diğer indikatörler vb maddelerin besiyerine ilavesi ile yapılır. Diferansiyel besiyerleri, amaca göre selektif izolasyon, selektif sayım ve ön identifikasyon amaçları ile kullanılmaktadır 

c) Zenginleştirme Besiyerleri;
           Karışık bir mikroflora içinde hedeflenen bir mikroorganizmayı geliştirmek, sayısını artırmak vb amaçlarla kullanılan zenginleştirme besiyerleri, ön zenginleştirme besiyerleri ve selektif zenginleştirme besiyerleri olarak 2 alt gruba ayrılırlar.
Ön zenginleştirme besiyerleri genel olarak hasar görmüş (= injured = yaralanmış) mikroorganizmaların aktivitelerini kazanmaları için kullanılan, bileşiminde inhibitör içermeyen ve dolayısı ile aktivite kazanması istenen mikroorganizma yanında refakatçi mikrofloranın da gelişmesini sağlayan sıvı besiyerleridir. Ön zenginleştirmede kullanılan besiyerlerine en tipik örnek gıdalarda Salmonella aranmasına yönelik çalışmaların ilk aşaması olan "ön zenginleştirme" amacıyla kullanılan Tamponlanmış Peptonlu Su besiyeridir.Bu besiyerinde Salmonella yanında ortamdaki diğer bakteriler de gelişebilmektedir.
Selektif zenginleştirme besiyerleri ise özel amaçla kullanılan selektif sıvı besiyerleridir. Bunlara en tipik örnekler ise Listeria ve Salmonella aranmasında kullanılan besiyerleridir. Selektif zenginleştirme aşamasında karışık kültür olarak bulunan bakterilerden gelişmesi istenmeyenler çeşitli selektif inhibitörler ile engellenir

d) İdentifikasyon Besiyerleri;
           Tam selektif bir besiyerinde gelişen bir mikroorganizmanın identifikasyonu cins ve hatta bazı durumlarda tür bazında tamamlanabilir. Diferansiyel besiyerlerinde de aynı durum geçerlidir.İdentifikasyon besiyerleri, mikroorganizmanın belirli bir besin maddesini (genellikle karbohidratlar) kullanıp/kullanmadığının saptanması, belirli bir besin maddesinden metabolizma sonunda tayin edilebilecek metabolitleri (örneğin triptofandan indol) oluşturup/oluşturmadığının belirlenmesi vb amaçlar ile kullanılır.

f) Diğer Besiyerleri Çeşitleri;
            Antimikrobiyel duyarlık testlerinde kullanılan agar disk difüzyon besiyerleri ile minimal inhibisyon konsantrasyonu testlerinde kullanılan sıvı ve katı besiyerleri, vitaminlerin ve aminoasitlerin mikrobiyel yolla belirlenmesinde kullanılan besiyerleri, saf kültürlerin korunması (=kolleksiyonu) amacıyla kullanılan besiyerleri, taşıma besiyerleri gibi özel amaçlara yönelik olarak kullanılan çeşitli besiyerleri de vardır.
Mikroorganizma arama analizleri gıda, çevresel ve klinik materyalde genellikle patojenlerin varlığının araştırılması şeklinde iken, endüstriyel mikrobiyolojide tam tersine olarak yüksek nitelikteki izolatların elde edilmesi amaçlanır.

Y.Y.Ü. VETERİNER FAKÜLTESİ

[eXcaLibuN]

paylaşım için teşekkğrler genel mıkrobıyolojıde öğrenmemız gereken bılgıler saoll....

[humerus10]

cok saol gercekten