GençVeteriner | Veteriner Hekimlik ve Evcil Hayvan Portalı
Veteriner Hekimlik Ders Notları => Klinik Öncesi Bilimleri Bölümü => Viroloji => Konuyu başlatan: eXcaLibuN - 30 Aralık 2006, 16:15:21
-
İMMUNFLORESAN TESTİ- IF
Floresan bileşikleri ile işaretli antikor kullanılarak, şüpheli materyalde bulunan antijen ya da bunlara karşı oluşmuş antikor varlığının araştırıldığı, immunositokimyasal bir yöntemdir.
Floresan bileşikleri ile işaretli antikora “Konjugat” denir.
İşaretleyici maddeler, floresan bileşikleridir. Bu maddeler, floresan ışık altında renkli parıldama oluştururlar.
KONJUGATIN YAPISINDAKİ ANTİKOR
• Tespiti amaçlanan etken için spesifiktir. (Örneğin IF testi “A” antijeninin varlığını araştırmak için yapılıyor ise antikor, “A” antijenine karşı oluşmuştur)
• Primer antikora spesifiktir. (Örneğin sığır serumunda B antikoru varlığı aranıyor ise anti-sığır IgG’ler konjugatın yapısında bulunur)
• Direkt IF ve NIF testinde konjugat antijene karşı, indirekt IF testinde ise primer antikora karşı hazırlanmıştır.
TEST YÖNTEMLERİ
• Direkt IF Testi: Antijen Tespiti için,
• İndirekt IF Testi: Antikor Tespiti için,
• Nötralizasyon IF Testi: Antikor Tespiti için
KULLANIM AMAÇLARI
• Marazi madde inokule edilen hücrelerde antijen tespiti
• Doğal enfekte hücrelerde antijen tespiti (nazal epitel ve sperma)
• Patolojik materyallerde antijen tespiti
• Antikor tespiti
• Virus titrasyonu ve histoloji gibi alanlar.
IF TESTİ İÇİN;
• Hücre Kültürü
• Konjugat
• Virus (Bilinen ya da Şüpheli)
• Serum (Bilinen ya da Şüpheli)
• Floresan Mikroskop
DİREKT IF TESTİ
• CCSC tüplerinde monolayer olarak üretilmiş hücre kültürlerine şüpheli materyalden inokulasyon yapılır.
• Uygun inkubasyon süresini (24-72 saat) takiben hücre yüzeyleri yıkanır.
• Ortama konjugat ilave edilir. 1 saat inkubasyondan sonra hücre yüzeyleri yeniden yıkanır, ve hücreler floresan mikroskopta kontrol edilir.
DİREKT IF TESTİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ
• Floresan parıldama (+) ise, Direkt IF (+)’dir.
• Floresan parıldama (-) ise, Direkt IF (-)’dir.
İNDİREKT IF TESTİ
• CCSC tüplerinde monolayer olarak üretilmiş hücre kültürlerine bilinen virus inokule edilir.
• Uygun inkubasyon süresinden (24-72 saat) sonra ortama şüpheli serumdan konulur ve 1 saat 37°C’de inkube edilir.
• İnkubasyondan sonra hücre yüzeyleri yeniden yıkanarak,konjugat ilave edilir ve 37°C’de 1 saat inkube edilir. İnkubasyondan sonra hücreler floresan mikroskopta kontrol edilir.
İNDİREKT IF TESTİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ
• Floresan parıldama (+) ise, İndirekt IF (+)’dir. (Şüpheli serumda bilinen virusa spesifik antikor vardır)
• Floresan parıldama (-) ise, İndirekt IF (-)’dir. (Şüpheli serumda bilinen virusa spesifik antikor yoktur)
ENZİM LİNKED İMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)
• Enzim ile işaretli antikorlar (konjugat) ve substrat kullanılarak, şüpheli materyalde bulunan etken (veya antijen) ya da bunlara karşı oluşmuş antikor varlığının araştırılması amacıyla kullanılan bir yöntemdir.
KULLANIM AMAÇLARI
1. Şüpheli materyalde etken/antijen varlığının araştırılması,
2. Antikor tespiti.
Konjugat: Enzim ile işaretli antikor (İşaretleyici madde+antikor)
• ELISA testinde kullanılan işaretleyici enzimler peroksidaz, alkalen fosfotaz, glukoz oksidaz vb. gibi.
• Yüksek dayanıklılığa (stabilize) sahip olmaları nedeniyle genellikle peroksidaz ve alkalen fosfotaz kullanılır.
Konjugatın Yapısındaki Antikor
Tespiti amaçlanan etken veya antikor için spesifiktir.
SUBSTRAT
• Konjugatın yapısındaki enzim ile reaksiyona girerek, antijen-antikor komplekslerinin oluşumunu ortaya koyan maddedir. Reaksiyon sonucunda substratın yapısındaki kromojen maddenin yapısına göre mavi, yeşil, sarı vb. renklerde ürünler oluşur.
KONJUGAT-SUBSTRAT İLİŞKİSİ
• Konjugat-Substrat = Renk
TEST YÖNTEMLERİ
• Direkt ELISA (Antijen tespiti için)
• İndirekt ELISA (Antijen veya Antikor tespiti için)
DİREKT ELISA
• Yöntemin esası, ELISA tabletine kaplanmış, şüpheli antijene spesifik antikorlardan yararlanarak antijenin varlığının ortaya konmasıdır.
TESTİN UYGULANIŞI
• Tablet, bilinen antikor ile kaplanır.
• Şüpheli materyal (?) konulur.
• Virusa spesifik konjugat ilave edilir.
• Substrat konulur.
NOT: Her basamaktan sonra uygun süre inkubasyonu takiben yıkama işlemi yapılır.
İNDİREKT ELISA
• Yöntem, şüpheli serumda antikorların saptanması ve titrelerinin ölçülmesi amacıyla kullanılır.
TESTİN UYGULANIŞI
• Tablet, bilinen antikor ile kaplanır.
• Şüpheli kan serumu ilave edilir.
• Antikora spesifik konjugat ilave edilir. (Anti-antikor)
• Substrat konulur.
NOT: Her basamaktan sonra uygun süre inkubasyonu takiben yıkama işlemi yapılır.
www.gencveteriner.com
-
teşekkürler