1.GİRİŞ
Bakteriler ilk defa 17. yy. da mikroskobun keşfiyle birlikte Antony Van Lövenhuk tarafından bulunmuştur. Fakat ondan önce 10. yy. da İbn-i Sina ve 15. yy. da Akşemseddin gibi düşünürler bakterilerin varlığını bilip onları hastalıkların sebebi olarak belirlemişlerdir. Bakteriler dünyada en çok sayıda bulunan canlılar olup bulunmadığı yer yok gibidir. Toprağın 5 m derinlerine kadar olan kısımlarda tatlı ve tuzlu sularda canlı vücutlarında çok sayıda bakteri bulunur. Çoğunlukla yararlıdır fakat zararlı türleri de vardır. (kaynak 1 )*
Monera alemini oluşturan prokaryot canlıların en yaygın ve en çok bilinen grubu bakterilerdir. O kadar yaygındır ki bugün dünyamızda bakterinin bulunmadığı yer yoktur diyebiliriz. En çok organik atıkların bol bulunduğu yerlerde ve sularda yaşarlar. Bununla beraber, -90 °C buzullar içinde ve +80 °C kaplıcalarda yaşayabilen bakteri türleri de vardır. Hava ile ve su damlacıkları ile çok uzak mesafelere taşınabilirler. Deneysel olarak ilk defa 17. yüzyılda bakterileri gözleyebilen ve onların şekillerini açıklayan Antony Van Lövenhuk olmuştur. Bakteriler bütün hayatsal olayların gerçekleştiği en basit canlılardır. Hepsi mikroskobik ve tek hücrelidirler. Büyüklükleri normal ökaryotik hücrelerin mitokondrileri kadardır.(kaynak 2 )**
2. BAKTERİLER VE GENEL ÖZELLİKLERİ: Çok değişik ortamlarda yaşamlarını sürdürebilen bakterilerin özellikleri şunlardır.
—Monera alemine ait canlılardır.
—Prokaryot hücreli olup monoploit (n)kromozomludurlar.
—Tüm genetik yapısına genom denir.
—DNA ve RNA olmak üzere iki çeşit nükleik asit bulunur.
—DNA’ları çembersel şekildedir.
—Hücre zarı ve sitoplazmaları vardır.
—Sitoplazmalarında protein ve enzim sentezlemelerini sağlayan ribozomlar bulunur.
—Sitoplazmalarının yaklaşık %90'nı sudur.
—Hücre zarının üstünde hücre çeperi (duvarı) bulundururlar. Bu duvar, bitki hücrelerinde olduğu gibi selüloz özellikte olmayıp mukopolisakkarit yapıdadır.
—Bazı bakteriler hücre çeperinin üzerinde kapsül ve zarf bulundurur.
—Sitoplazmalarında yağ, protein ve glikojen tanecikleri bulundurabilirler.
—Oksijenli solunum yapan bakterilerin hücre zarının bir kısmı sitoplazmaya doğru mesozom denilen çıkıntılar oluşturur. Bu bakterilerde solunum enzimlerinin bir kısmı mesozom üzerindedir, bir kısmı ise sitoplazmada bulunur.
—Bakteriler uygun olmayan koşullarda su kaybederek endospor oluşturur. Endospor bir üreme şekli olmayıp bakterilerin kalıtım materyalinin nitelik ve niceliğini uygun olmayan çevre koşullarına karşı korur. Şartlar uygun hale gelince endospor kabuğu çatlar ve bakteri eski yaşamına geri döner. (kaynak 3)***
* kaynak1: (
www.biology.sebat.edu.kg)
** kaynak2: ( Bilim ve Teknik, Temmuz 1999)
*** kaynak3: (
www.stu.inonu.edu.tr)
3. BAKTERİLERDE ÜREME
Mikroorganizmalar, uygun besi yeri ve çevresel koşullar altında, türlerine özgü bir süratle ürerler. Koşulların uygunluğu devam ettiği sürece, buna paralel olarak çoğalma da sürekli olur. Ancak, laboratuarlarda, mikroorganizmaları üretmede sınırlı miktarda besi yerleri kullanıldığından, mikropların üremeleri kısıtlanır. Mikroplar üredikçe, ortamdaki gıda maddeleri azalır ve tükenir. Optimal koşulların değişmesi (pH, ozmotik basınç, oksijen, yüzey gerilimi, vs.) ve besi yerinde toksik metabolitlerin birikmesi, miktarı az olan besi yerinde üremeyi kısa bir süre sonra baskılar ve durdurur. Örn, her 20 dakikada bir defa bölünerek üreyen E. coli hücresinden, uygun koşullar devam ettiği sürece 48 saat içinde 2114 (veya 2.2x1043) hücre meydana gelir. Yukarıda bildirilen nedenlerle üremenin kısıtlanacağı, aynı zamanda her hücrenin tekrar bölünme olasılığının sınırlanacağını ve her mikrop için bölünme süresinin 20 dakika olmayacağını düşünülürse, bildirilen rakamlara ulaşmanın güçlüğü ortaya çıkar.
İnsan ve hayvanlarda hastalık oluşturan yuvarlak (streptokok, stafilokok, diplokok, Neisseriae'lar, vs.), çomak bakteriler (pastörella, korinebakteri, mikobakteri, salmonella, brusella, vibrio, vs.), aerobik basiller (B. anthracis, B. subtilis, B. cereus, vs.), klostridium sınıfına ait bakteriler (C. tetani, C. botulinum, C. septicum, C. welchii, vs.) ve sarmal biçimdeki (spiroketler) mikroplar kısa eksen boyunca ortadan ikiye bölünmek suretiyle ürerler. Sporlu olan aerobik ve anaerobik mikroplarda sporlar üreme aracı değildirler. Bu basillerin vegetatif formları da aynı şekilde ortadan ikiye bölünmek suretiyle çoğalırlar
Bölünme başlamadan önce, bakteri, iki kardeş hücreye yetecek kadar enzimleri, gerekli diğer organik ve inorganik maddeleri hazırlar ve biriktirir. Bu işlemler yapılırken hücre içinde özellikle nükleer bölgede bir organizasyon görülür. Toplu halde bulunan nukleus orta bölgede uzamağa başlar. Nukleus sitoplazmik membrandaki özel yere (muhtemelen mesosom) bağlanarak replikasyona başlar. Replikasyon tamamlanınca, hücre duvarından içeri doğru ve karşılıklı olarak bir septum oluşumu görülür. Buna, sitoplazmik membran da iştirak eder ve septumlar içeri doğru uzayarak hücreyi ortasından iki kardeş hücreye ayırır. Bu iki hücre birbirinden ayrılarak tam bağımsız hale gelirler veya birbirlerine bitişik olarak kalırlar (streptokok, streptobasil, flamentöz formlar.)
Bütün bakteriler bölünerek çok hızlı çoğalabilirler.
Şekil: Bir Bakterinin Bölünerek Çoğalması
**** kaynak4: (18 mart üniversitesi fen - edebiyat fakültesi moleküler biyoloji- mikrobiyoloji A.B.D)
Bakterilerde, zarlı bir çekirdek olmadığından ve kromozom sadece bir tane olduğundan bölünme tam bir mitoz değildir. Bu tür hücre bölünmesine gizli mitoz denir. Bazı bakteri türleri, bölünerek (eşeysiz) üremenin yanında eşeyli üremeyi de gerçekleştirebilirler. Bu üremede gamet oluşumu ve döllenme görülmez. Kalıtsal yapısı farklı iki hücre aralarında bir köprü oluşturarak gen aktarımı yaparlar. Sonuçta her iki atadan da farklı bir hücre (rekombinant bakteri) oluşur. Bu çeşit üremeye konjugasyon (kavuşma) denir. Konjugasyon sonucunda kalıtsal çeşitlilik sağlanır.
Şekil: Bakterilerde Konjugasyonla Eşeyli Üreme
Bazı bakteriler olumsuz ortam şartlarını endospor oluşturarak atlatırlar. Bakteri parçalansa ve ölse bile, endospor ortam şartlarına dayanır. Şartlar normalleştiğinde gelişen endospor normal bakteriyi oluşturur.
3.1. EŞEYSİZ ÜREME:
Eşeysiz üreme ile çoğalırlar. Yaşadıkları ortamda yeterli besin, su, uygun sıcaklık, bulunursa her 20 dakikada bir bölünerek geometrik dizi şeklinde çoğalırlar. Fakat çok geçmeden ortamda su ve besin tükenir ve ortamda biriken alkol, asit ve çeşitli kimyasal maddeler bakterilerin üremesini sınırlar. Genetik çeşitlilik gözlenmez. Bu tür üremede erkek ve dişi hücreler oluşmaz. Mikroorganizmalar ortadan bölünerek, tomurcuklanarak ve sporlanarak çoğalırlar.
.
1- Ortadan bölünme: Çomak ve sarmal biçimdeki mikroorganizmalar kısa eksenleri ve yuvarlak şekilde olan mikroplarda herhangi bir çap boyunca, ortadan bölünerek çoğalırlar.
2- Tomurcuklanma: Mayalar (saccharonmycesler) ve bazı mantarlar (candida, criptococcus, histoplazma, blastomyces) tomurcuklanarak ürerler. Ana hücrenin bir kenarında oluşan tomurcuk giderek büyür ve olgunlaştıktan sonra ana hücreden ayrılarak bağımsız bir hücre haline gelir ve yaşantısını aynı tarzda sürdürür. Bazen hücreler birbirine bağlı kalarak tesbih gibi bir görünüm alırlar.
3- Sporlanma- Bakterilerde oluşan endosporlar bir aracı olmamasına karşın mantarların çoğu (aspergillus, penicilium, rehisophus, mucor vb.) Aseksüel tipte sporlar (arthrospor, blastospor, chlamydospor, conidispor sporangiospor) oluşturarak ürerler.
3.2. EŞEYLİ ÜREME:
Eşeyli üreme iki ayrı cins hücrenin (erkek ve dişi) birleşerek oluşturdukları döllü hücre (zigot) aracılığı ile sağlanır. E.coli de fertilite faktörü taşıyan F+ hücrelerde, bu faktörü taşımayan F- hücrelere konjugasyon tüpü aracılığı ile bu faktör ile birlikte genetik materyalde aktarılmaktadır. Ancak bu aktarılma olayı bir üreme tarzı değildir ve verici hücre ile alıcı, aynı şekilde, ortadan bölünerek çoğalırlar. İki bakteri yan yana gelir. Aralarında sitoplazmik köprü kurulur. Gen aktarımı olur. Buna konjugasyon denir. Sayıca artma olmaz. Çeşitlenme (Varyasyon) sebebidir. Bakterilerde eşeyli üreme ile daha dayanıklı bakteri tipleri oluştururlar.
3.3. SIVI ORTAMDA ÜREME
Mikroorganizmalar optimal koşulları içeren sıvı ortamlarda, katı besi yerlerinden daha çabuk ürerler. Üremenin hızı, mikrop türüne özgü genetik bir karakter olmakla beraber, besi yerinin bileşimi ve çevresel koşullarla da yakından ilişkilidir. Mikroorganizmalar, ikiye bölünmek suretiyle geometrik bir üreme tarzı gösterirler.
Bakterilerde geometrik üremenin matematiksel ifadesi de (1x2n)'dir. Bakteri populasyonunda meydana gelen her bölünmeye generasyon ve iki generasyon arasında geçen zamana da generasyon süresi adı verilir. Her generasyon sonunda populasyondaki fert sayısı iki misli artar. Generasyon süresi bakterilerde çok değişiklik gösterir. E. coli'de 18–20 ve S. aureus'da 27–30 dakika olan generasyon süresi, Mycobacterium tuberculosis'de 792–932 dakikadır.
Uygun bir besi yerine ekilen bir mikroorganizmanın belli bir süre içindeki üreme durumu başlıca 4 evre gösterir. Yandaki şekilde a)Latent dönem, b)Üreme dönemi (logaritmik dönem), c)Durma dönemi, d)Ölme dönemi görülmektedir.
Bakterilerin Uygun Sıvı Ortamda Üremesi
3.3.1. Latent dönem:
Bu fazda yeni veya değişik ortama ekilen mikroplarda üreme olmadığından sayıca da bir artma olmaz. Buna karşın, bakteriler yeni enzimler, metabolik intermedierler ve gerekli maddeleri sentezlediğinden, metabolizma artmıştır. Bu dönem, aynı zamanda, mikroorganizmaların, ortama adaptasyonlarını da sağlar. Adapte olamayanların ölmeleri nedeniyle mikrop sayısında azalmalar da görülebilir. Ortama uyabilen ve yeni maddeler hazırlayan mikroorganizmalar belli bir latent devreden sonra bölünerek üremeye başlarlar. Bu dönemin uzunluğu veya kısalığı mikropların türüne bağlı olmakla beraber, çevresel koşullara (pH, ısı, ozmotik basınç, yüzey gerilimi, oksijen, vs.), besi yerinin bileşimine, ekilen mikropların ilk alındığı kültürünün dönemine de bağlıdır.
3.3.2. Üreme dönemi (logaritmik dönem):
Yeterince ve gerekli maddeleri alan, sentezleyen ve latent fazı geçen mikroplar, kendi türlerine özgü bir generasyon süresi içinde ve belli aralıklarla bölünerek çoğalmaya başlarlar. Bakteri sayısı ve bölünme zamanla orantılı olarak artar. E. coli'de bu süre 18–20 dakika arasında değişmesine karşın, mikobakteriler de 800–900 dakika kadardır. Ancak, aynı tür mikroorganizmalar, üreme döneminde olsalar bile, yine aralarında biraz geç veya biraz kısa süre içinde bölünenler bulunacaktır ve hatta hiçbir bölünmeyenler de olabileceği gibi.
Bakteri hücresinin bölünmesi, biyokimyasal aktivite ile de paralellik gösterir. Bu dönemdeki kültürler, belli zaman aralıklarında sayıma tabi tutulurlarsa üreme eğrisi düz veya dik bir durum gösterir (B). Bu fazda fizyolojik olarak çok aktif olan mikroorganizmalar, fiziksel ve kimyasal etkenlere karşı çok duyarlıdırlar. Mikroplar, bu dönemde, birçok karakterleri yönünden de bir örneklik gösterirler. Üreme dönemi çok uzun bir süre devam etmez. Birkaç saat sonra bölünme hızında yavaşlama başlar.
3.3.3. Durma dönemi:
Mikropların ürediği sınırlı miktardaki sıvı ortamdaki bozulan optimal koşullar değişmediği veya düzeltilmediği takdirde, üreme giderek yavaşlar. Bakteri populasyonu bir süre sayıca değişmeden kalır ve sonra azalmaya başlar. Bu fazda bulunan tüm mikroplarda, bölünme birden durmaz. Bazıları yavaşta olsa, bu uygunsuz koşullara adapte olabilir ve üremelerini sürdürebilir. Ancak, böyle mikropların sayısı, tüm populasyona oranla çok azdır. Durma döneminin uzunluğu veya kısalığı, besi yerinin miktarı, bileşimi, üreyen mikrobun türü ve çevresel koşullara göre değişiklik gösterebilir. S. pneumoniae 'de çok kısa olun bu dönem, E.coli'de 2–3 gün veya daha fazla olabilmektedir. Durma dönemi uzadıkça mikroorganizmaların morfolojilerinde (involusyon formları), kültürel özelliklerinde (R-formlarının artması) ve fizyolojik karakterlerinde (boyama reaksiyonları, pigment oluşumu, vs.) bazı değişmeler meydana gelir.
3.3.4. Ölme dönemi:
Durma devresi değişmedikçe, mikroplar bu uygun olmayan koşullar altında ölmeye başlarlar. Populasyon, sayıca giderek, azalır. Ancak, bütün mikroplar ölmeyebilirler. Bazıları canlılıklarını koruyabilir. Bu nedenle de canlılık eğrisi sıfıra ulaşmaz. Kültürün steril hale gelmesi mikroplar arasında farklı bir durum gösterir. Örn. S. pneumoniae ve N. Gonorrhoea iki üç gün içinde ölür ve otolize olur. E. coli 'de bu süre daha uzun ve M. tuberculosis 'de ise çok daha uzundur (aylar). Ölme döneminde canlı kalabilen mikropların morfolojilerinde değişiklikler meydana gelir (involusyon formları).
3.4. KATI ORTAMLARDA ÜREME
Katı ortamda ekilen mikroorganizmalar, sıvı besi yerlerine oranla daha sınırlı bir üreme şansına sahiptirler.
Koloniler oluşmaya başladıktan sonra birçok faktörlerin etkisi altına girerler ve bunlar da büyüme ve üreme üzerine genellikle olumsuz yönde etkilerler. Bu nedenlerin başında;
1-Kolonilerin üst kısmında veya tepe bölgesinde bulunan mikroplara gıda maddelerin diffusyon ulaşması güçleşir.
2-Kolonilerin altında ve civarında bulunan gıda maddeleri kısa bir süre sonra azalmaya başlar ve buna bağlı olarak da diffusyon sınırlanır.
3-Kolonilerden uzak bölgelerde bulunan gıda maddelerinin koloniye kadar gelebilme olasılığı azalır.
4-Hücre içinde oluşan metabolizma artıkları ve toksik maddeler dışarı atılamaz ve hücre içinde birikirler. Bu nedenle de metabolizma bozulur ve üreme kısıtlanır. Aynı durum, hücre dışına çıkması gereken ve çok lüzumlu göreve sahip olan enzimler için de söz konusudur.
5-Kolonilerin en üstündeki mikroorganizmalar gıdayı yeterince alamadıkları için dejenere olmaya başlarlar.
6-Etrafta gelişen diğer koloniler nedeniyle, beslenme alanı giderek daralır.
7-Basınç nedeni ile koloninin alt yüzünde bulunan mikroplar da dejenerasyon görülebilir. Ancak petri kutusu etüve ters konulduğundan bu basınç üreme döneminde oldukça azdır.
8-En alttaki mikroplardan dışarı çıkabilen toksik maddeler agarın yüzeyine yayılırlar.
9-Mikroplar birbirine bitişik durumda olduklarında, üreme kısıtlanır. Ancak, kenardakiler serbest üreme şansına sahiptirler.
10-Katı ortamlarda gıda diffusyonu genellikle güçtür.
11-İnkubasyon ısısı nedeniyle, besi yerinden devamlı su kaybı, ortamın kurumasına ve diffusyonun daha zorlaşmasına sebep olur.
Yukarıda bildirilen nedenlerle bir bakterinin katı ortamda üremesi, sıvı besi yerlerine oranla daha zor olmakta, generasyon süresi, sayısı ve populasyon miktarı bakımından da noksanlıklar göstermektedir. Katı ortamlar ne kadar yumuşak ve koloni sayısı da az olursa, gelişme ve üreme daha fazla olur ve koloni çapı büyür.
Kolonilerin uygun besi yerlerinde gözle görülebilir bir düzeye ulaşabilmesi için geçen süre mikroorganizmalar arasında değişiklikler gösterir. Bu durum, mikropların cins ve türlerine özgü bir karakterdedir. E. coli, P. vulgaris, P. aeruginosa, S. aureus ve diğer bazı mikroplar 24 saat içinde veya daha kısa bir sürede gözle görülebilecek büyüklükte koloniler oluşturmasına karşın, S. enteritidis, S. pyogenes, C. pyogenes genellikle 48 saatten sonra, B. abortus ve diğer brusella türleri, PPLO'lar 4–5 günden sonra görülebilir düzeyde koloniler meydana getirirler. M. tuberculosis 'de bu süre 15–20 gün kadar sürer.
3.6. ÜREMENİN ÖLÇÜLMESİ
Mikroorganizmaların üremelerini saptamak için uygun optimal koşullarda üremiş kültürler kullanılmalıdır. Belli bir süre inkübatörde tutulduktan sonra mikropların üremesi çeşitli yöntemlerle tayin edilir.
1-Hacmin ölçülmesi: Belli bir süre sıvı besi yeri içinde üreyen mikroplar, dibi konik ve taksimatlı santrifüj tüplerine alınarak kuvvetlice santrifüje edilir. Üsteki sıvı atıldıktan sonra, dipte kalan tortunun miktarı santimetreküp olarak değerlendirilir ve hacim olarak ölçüsü bulunur.
2-Kuru ağırlık tayini: Santrifüj yardımı ile çöktürülen ve distile su ile birkaç kez yıkanan belli miktardaki kültürde bulunan mikroorganizmalar, ısıya dayanıklı belli ağırlıktaki kaba konarak 120 °C 3 saat ısıtılır. Soğuduktan sonra tartılır. Ağırlığı sabit kalıncaya kadar ısıtma ve soğutma işlemine devam edilir. Böylece elde edilen ve değişmeyen ağırlık, mikropların kuru ağırlığını verir. Kuru ağırlığın miktarı, üremenin çokluğu veya populasyonun miktarı ile ilişkilidir.
3-Yaş ağırlık tayini: Santrifüjle çöktürülen ve birkaç kez yıkanan tortu, ya tüple birlikte veya ayrı olarak tartılır. Bu suretle belli bir süre ve miktardaki kültürdeki bakteri ağırlığı saptanmış olur.
4-Total azot tayini: Bakteri içinde bulunan maddelerdeki nitrojen miktarının tayini duyarlı yöntemler arasında bulunmaktadır. Bu tür nitrojen miktarının bulunmasında mikro-Kjeldahl tekniğinden yararlanılır.
5-Bulanıklık (türbidite) tayini: Belli miktardaki kültürlerde muayyen süre inkube edilmiş olan mikropların üreme durumu, ya standart bulanıklık tüpleri (McFarland, Brown) ile karşılaştırarak veya spektrofotometrik yöntemle (optikal densite tayini ile) tespit edilir.
6-Sayma suretiyle: Katı ortamlarda üreme durumunu anlamak için birçok yöntemler uygulanırsa da en çok kullanılanı koloni sayma tekniğidir.
Başlıca mikrop sayma teknikleri:
a) Boyalı preparatlarda, mikroskop altında direk sayma tekniği,
b) Petroff-Hause aleti ile mikrop sayma yöntemi,
c) Breed metodu ile frotideki mikropların sayılması,
d) Karşılaştırma tekniği ile mikropların miktarının bulunması,
e) Partikül sayımı (Coulter counter ve diğer aletlerle),
f) Dilusyonla sayma tekniği,
g) Koloni sayma usulü,
h) Sellüloz filtreleri ile mikrop sayımı
4.1. Genel Bilgiler
Mikroorganizmalar bulundukları ortamlarda (kültürler de dahil), optimal koşullar altında, cins ve türlerinin genetik karakterine göre, iyi bir üreme ve gelişme gösterirler. Ancak, bu uygun şartlar, aynı durumda uzun bir süre devam etmez ve belli bir zaman sonra, mikroorganizmaların üremeleri sınırlanır ve durur. Eğer, olumsuz koşullar değiştirilmezse veya iyileştirilmezse, mikroorganizma populasyonunda ölümler başlar, giderek artar ve canlı mikroorganizma sayısında azalmalar meydana gelir. Ancak, canlı kalmayı başarabilen mikroplarda da, morfolojik bazı değişiklikler (şekillerinde bozukluklar: flamentöz, branşlı, pleomorfik ve diğer aberent formlar) ortaya çıkar.
Yukarıda bahsedilen durumlar, genellikle, doğal koşullar altında meydana gelen bazı olumsuz faktörlerin mikroorganizmaların üremeleri üzerine olan etkilerini kapsamaktadır.
Böyle etkiye sahip faktörleri başlıca 4 grupta toplamak mümkündür. Bunlar da,
1) Fiziksel faktörler
2) Kimyasal faktörler
3) Biyolojik faktörler
4) Mekanik faktörler
4.2. Fiziksel Faktörler
Yeryüzünde (toprakta, sularda, göllerde, denizlerde, havada, evlerde, barınaklarda, vs.) ve canlıların vücudunda, değişik fiziksel, kimyasal biyolojik ve doğal koşullara adapte olmuş, yaşayan ve üreyen mikroorganizmalar bulunmaktadır. Bakteriler, 20° Güney paralelinden 90° Kuzey paraleline kadar, okyanus sularında, değişik derinliklerde ve ortamlarda oldukça farklı hidrostatik basınç altında kolayca yaşayabilecek tarzda bir adaptasyon göstermektedirler. Bazıları da sıcak su kaynaklarındaki 100 °C civarındaki sıcaklıkta ve bir kısmı da donma derecesindeki çevrede kolayca yaşayabildikleri belirlenmiştir.
Doğada bu kadar değişken, fazla ve olumsuz koşullara direnç gösteren ve adapte olan mikroorganizmalardan ancak çok azı canlılarda hastalık oluşturabilmektedir. Çünkü ekseri patogenlerin üreyebildiği sınırlar, üzerinde veya içinde yaşadıkları canlılarınki ile bir uyum göstermektedirler. Maksimal veya minimal sıcaklık sınırlarına yaklaşıldıkça veya geçildikçe, mikroorganizmalar üreseler bile virulens faktörlerinin etkinliğinde inhibisyon veya zayıflamalar oluşmaktadır. Kapsüllü mikroplar, bakteri ve mantar sporları çevre koşullarına çok dayanıklıdırlar ve uzun süre (yıllar) canlı kalabilir ve infeksiyöz yeteneklerini koruyabilirler.
Mikroorganizmaların üremeleri üzerine etkileyen önemli fiziksel faktörler aşağıda özet olarak belirtilmiştir.
4.2.1. Isının Etkisi
Mikroorganizmalar üzerine ısı başlıca iki tarzda etkilemektedir.
4.2.1.A.Sıcağın etkisi:
Ortamın sıcaklığı, mikroorganizmaların üremeleri üzerine büyük ölçüde etkiler. Mikroplar, genellikle, kendi türlerine özel sıcaklık limitleri (minimal ve maksimal) içinde gelişebilir ve üreyebilirler. Bu sınırlar arasında, üremenin en iyi meydana geldiği optimal sıcaklık bulunur. Bu uygun sıcaklıktan minimal veya maksimal hudutlara doğru gidildikçe üremenin yavaşladığı ve bu sınırları geçince üremenin durduğu görülür. Optimal sıcaklık maksimalden 5–10 derece daha düşük olmasına karşın, minimal sıcaklıktan genellikle 20–30 derece daha yüksektir. Maksimal limitin aşılması halinde yalnız üremede durma meydana gelmez, sıcaklığın yüksekliğine göre, mikroplarda az veya çok oranda ölümler de başlar. Buna karşılık minimal sıcaklık sınırının geçilmesi halinde üremede duraklama meydana gelir. Ölümler, sıcaklığın düşme hızına ve sıcaklık derecesine göre çok az olur. Mikroorganizmalar arasında sıcaklık limitleri bakımından bazı ayrılıklar vardır. Bu durum, mikropların doğal adaptasyon ve seleksiyonları sonu oluşmuştur. Patogenik mikroplar, en iyi gelişme ısısını (optimal sıcaklık), adapte oldukları konakçının içinde bulurlar. Diğer bir deyimle, bu tür mikroorganizmalar en iyi, konakçı sıcaklığında ürerler. Bu nedenle de, hastalık yapıcı karakterde olan mikropların üreme sıcaklığı varyasyonları çok geniş olmayıp, belli ve dar limitler arasında bulunmaktadır. Buna karşın, saprofitikler ve doğada serbest yaşayan diğer mikroorganizmaların, sıcaklık genişlik limitleri arası daha geniştir.
Mikroorganizmalar üreme sıcaklığı derecelerine göre başlıca 3 bölüme ayrılırlar:
a) Soğuk seven (psikrofil) mikroplar: Toprak, su, deniz ve göllerde yaşayan bazı mikroplar ile balıklarda ve soğukkanlı hayvanlarda hastalık oluşturan mikroorganizmalar bu bölüme girerler. Balıklarda hastalık meydana getiren gerek Gram negatif (A. salmonicida, C. psychrophila, H. piscium, V. anguillarum, vs.) ve gerekse Gram pozitif (korinebakteri, mikobakteri türleri, vs.) mikroplar 15–20 °C arasında iyi gelişme olanaklarına sahiptirler. Soğuk seven bazı mikroplar ve mantarlar buzdolabı sıcaklığında (+4 °C'de) kolaylıkla üreyebilir ve gıdaları bozabilirler. Bu nedenle psikrofilik mikroorganizmaların enzimleri -5 °C ile +20 °C’ler arasında aktivite gösterebilirler.
b) Ilık seven (mezofil) mikroplar: Bu mikroplar, genellikle 20–45 °C’ler arasında gelişme ve üreme kabiliyetlerine sahiptirler. İnsan ve hayvanlarda hastalık oluşturan mikroorganizmaların büyük bir kısmı, bu gruba dahildirler. Bu nedenle optimal sıcaklıkları 35 °C ile 42 °C’ler arasıdır. Mezofil mikroorganizmalar, 65 °C’de 20 dakikada ve pastörizasyon sıcaklığında (70 °C’de bir dakikada) ölürler.
c) Sıcak seven (termofil) mikroplar: Termofilik mikropların gelişme ve üreme sıcaklıkları, mezofillerin çok üstündedir (50–60 °C). Mezofiller bu sıcaklıkta yaşayamazlar. Bu tür mikroplara, sıcak su kaynaklarında, gübrelerde ve tropikal ülkelerde rastlamak mümkündür. Termofil mikroplar ve sporlar pastörizasyon ısısına dayanıklıdırlar. Sütlerin pastörizasyonundan sonra da ısıya dayanıklı birçok mikroplar canlı kalırlar. Konserve gıdaların sterilizasyonu bu nedenle önem kazanmaktadır. T. aquaticus, B. stearothermophilus, bu tür mikroplara örnek verilebilir.
Mikroplar yüksek sıcaklıkta ölürler. Ancak, sıcaklık yardımı ile ölme üzerine, sıcaklıktan başka, birçok faktörlerin de etkisi bulunmaktadır. Bunlar da kısaca şöyledir:
Yüksek sıcaklık; Maksimal limiti aşan sıcaklık, mikropların karakterine göre kısa ve uzun bir süre içinde ölümlere neden olur. Psikrofilik mikropların çoğu 30–35 °C’de, mezofillerin ekserisi 65 °C’de 20–30 dakikada, termofiller ise 80–90 °C’de tahrip olurlar. Sporlar 100–110 °C’de ve bütün mikroorganizmalar da rutubetli sıcaklıkta 120 °C’de 15–20 dakika içinde ölürler (sterilizasyon).
4.2.1.B) Soğuğun etkisi:
Mikroorganizmalar soğuğa sıcaktan, daha fazla dayanırlar. Minimal sıcaklığı geçince üremeleri duran mikroplar, bu limit çok aşılsa bile ölmedikleri görülür. Soğukluk –80 °C veya –190 °C olunca canlılıklarını ve infeksiyöz kabiliyetlerini uzun süre (yıllarca) koruyabilmektedirler. Bu nedenle, mikroorganizmalar (bakteri, mantar, virus) ve çeşitli hücreler (doku hücreleri, sperma, vs.) sıfırın çok altında (-190 °C’de) muhafaza edilmektedirler. Ancak, bazı mikropların özel duyarlılığını da göz önünde tutmak gereklidir. Ayrıca, donarken ve çözülürken populasyonda canlılık miktarında ve hastalık oluşturma yeteneğinde de azalmalar meydana gelir. Bakterilerin hücre duvarı, donma ve çözülme sırasında parçalanabilir. Eğer mikroorganizmalar çok kısa süre içinde dondurulur, kurutulur ve havası alınmış ampuller içinde saklanırsa uzun yıllar canlılıklarını ve aktivitesini koruyabilir (liyofilizasyon). Mikropların ve hücrelerin liyofilizasyonunda, steril yağsız süt, serum, gliserin, laktalbumin, sodyum glutamat, vs. gibi ara maddelerden yararlanılır.
Çeşitli sıvılar ve serumlar aynı şekilde, ya çok soğuk derecelerde veya liyofilizasyon suretiyle uzun yıllar muhafaza edilmektedirler.
Aşağıdaki çizelgelerde, bazı mikropların minimal, optimal ve maksimal üreme sıcaklıkları ile termal ölüm noktaları gösterilmiştir.
Mikroorganizma Minimum oC Optimum oC Maksimum oC
Psikrofiller -5 5 15 30 19 35
Mezofiller 10 15 30 45 35 47
Termofiller 40 45 55 75 60 80
E. coli 8 37 47
B. subtilis 8 28 40 50 55
C. tetani 14 37 43
N. gonorhoae 30 37 40
B. stearothermophilus 33 37 50 65 70
4.2.2. Radyasyonun Etkisi
Radyasyon, boşlukta veya materyal bir ortamda enerjinin dalgalar halinde yayılması olayıdır. Pratikte mikrobiyoloji alanında radyasyonlardan başlıca iki amaçla yararlanılır;
1- Sterilizasyon ve dezenfeksiyon,
2- Mutasyonlar oluşturmak için Radyasyonlar karakterlerine göre başlıca iki türdür
A) İyonizan olmayan radyasyonlar
1- Ultraviolet (mor ötesi) ışınları,
2- İnfrared (kızıl altı) ışınları,
3- Ultrasonik (ses ötesi) dalgalar.
B) İyonizan radyasyonlar
1) Elektromagnetik radyasyonlar
a- İks (X) ışınları,
b- Gama ışınları.
2) Partiküler radyasyonlar
a- Alfa ışınları,
b- Beta ışınları,
c- Katot ışınları
Mikrobiyolojide en çok kullanılan radyasyonlar ultraviolet ışınları, X ışınları, gama ışınları, katot ışınları ve ultrasonik vibrasyonlardır.
4.2.2.1. İyonizan Olmayan Radyasyonlar
*Ultraviolet (UV-) ışınları: Bunların dalga uzunlukları, diğer ışınlardan daha büyüktür. UV ışınlarının kuantum enerjisi düşük olduğundan iyonizasyon oluşturamaz ve ancak moleküllerde ekzitasyonlar meydana getirirler. Ultraviolet ışınlarının dalga boyları 10 nm ile 380 nm (100 A°-3800 A°) arasında değişmektedir. Bu ışınların bakteri, mantar, virus, spor ve hücreler üzerine letal etkileri vardır. Pratikte UV ışınları, cıva buharlı lambalardan elde edilir. Derinlere girememeleri nedeniyle, hastanelerde operasyon odalarının ve bazı özel yerlerin havasını ve burada bulunan eşyaların yüzeyini sterilize etmekte kullanılır. UV ışınlarının mikroplar üzerine, letal etkilerinden başka, mutagenik olarak ta tesir eder. Proteinlerin, özellikle, nükleik asitlerin, bu ışınlara karşı olan özel affiniteleri nedeniyle kolayca absorbe edilirler. Bunun sonucu olarak ta, DNA iplikçiklerinde yan yana bulunan timinler arasında bağların kurulması (timin dimerleri) olayı meydana gelir (dimerizasyon).
Oluşan bu dimerizasyon, DNA'nın normal yapısını çarpıtır. Bu durum DNA replikasyonuna, transkripsiyona ve dolayısıyla da translasyona etkileyerek bakteride protein sentezin ve diğer mekanizmaları bozar ve ölümlere neden olur. UV-ışınlarının dozajı artarsa bu sefer timin dimerleri yanı sıra, sitozin dimerleri de oluşmaya başlar ve ölümler çoğalır.
Absorbe edilemeyen ışınların DNA üzerinde etkileri çok zayıf veya yoktur. Dalga uzunlukları 300 nm.'den aşağı olanlar daha fazla absorbe edilirler.
Cam, su ve organik maddeler, UV ışınlarını absorbe ederek etkisini azaltırlar. Oksijensiz ortamlarda daha etkili olabilen UV ışınları, gözün retinası üzerinde bozukluk yaptığından, UV ışınları bulunan bir odaya özel gözlük takarak veya UV ışığı söndürülerek girilir.
*Fotoreaktivasyon: Eğer bakteri hücreleri UV-ışınlamasından sonra hemen, görülebilen ışınlara (300–400 nm. dalga boyu) tutulursa, UV-ışınlarının letal etkileri azalır. Bu olay, UV-ışınlaması sonu oluşan primidin dimerlerinin görülebilen ışınlarca aktive edilen özel enzimler tarafından, hidrolize edilerek giderilmesi sonu meydana gelir. Böylece, dimerler ortadan kaldırılarak bozukluk tamir edilir.
Işıkta yapılan bu tamir mekanizması yan ısıra bakterilerde, karanlıkla iş görebilen ve dimerizasyonu gideren diğer bir tamir sistemi daha bulunmaktadır (karanlıkta tamir). Bu mekanizmada 4 enzim (endonuklease, ekzonuklease, DNA polimerase, polinukleotid ligase) görev alır ve bozulan bölgeyi tamir ederler.
4.2.2.2. Güneş Işınları
Güneş ışınları dünya için iyi bir radyasyon kaynağıdır. Güneş ışınlarını, görülebilen ışınlar, UV ışınları, infrared ışınları ve radyo dalgalar oluşturur. Özellikle ısınmayı da infrared ışınları sağlar. Görülebilen ışınların, dünyadaki yaşam için önemi çok fazladır. Fotosentetik organizmalar ışık enerjisinden yararlanırlar. Güneş ışınlarının %60'ını infrared ışınları teşkil eder.
Güneş ışınları (UV ışınları), mikroorganizmalar üzerine, hem mutasyonlar oluşturarak ve hem de sıcaklığı ile etkiler.
4.2.2.3. İnfrared Işınlar
Biyolojik materyallerde kimyasal değişikliğe neden olabilecek kuantum enerjisine sahip olmadıklarından pratikte değerleri azdır. Dalga uzunlukları çok büyüktür.
4.2.2.4. Ultrasonik Vibrasyonlar
Ses dalgalarının 20–1000 Kc. olanları bakteri hücrelerini parçalayabilecek niteliktedirler. Bu durumdan yararlanılarak, enzimatik çalışmalar ve bakterilerin içyapı karakterlerini incelemek mümkün olabilmektedir. Ultrasonik dalgalarının frekansı arttıkça, parçalayıcı etkisi de artar. Sıvı içinden geçen ses dalgaları 10 mikrometre çapında boşluklar meydana getirir. Bunlar birbirleriyle birleşir ve sonra da kollapse olurlar.
Ultrasonik vibrasyonlar, hücre içindeki makromoleküllerin ve intramoleküler organizasyonların depolimerizasyonuna yol açar. Ultrasonik vibrasyonlara stafilokoklar dirençli olmasına karşın, diğer Gram pozitif ve negatif mikroorganizmalar daha duyarlıdırlar.
Hücreleri parçalayarak içindeki virusları dışarı çıkarmada ultrasonik vibrasyonlardan yararlanıldığı gibi suların sterilizasyonunda da aynı amaçla kullanılmaktadırlar.
4.2.2.5. İyonizan Radiyasyonlar
İyonizan ışınlar, fiziksel özelliklerine göre iki kısma ayrılırlar;
1- Elektromagnetik olanlar
2- Partiküler olanlar. Bu ışınların dalga boyları çok kısadır ve derinlere girme kabiliyeti fazladır. Bu özelliklerinden yararlanarak pratikte sterilizasyon amacıyla kullanılırlar. Çok fazla enerjiye sahip olduklarından atomlardan elektronların çıkmasına neden olurlar (iyonizasyon) ve letal etkileri de çok fazladır. Bu etkileri, absorbe edilen enerji miktarı ile bağıntılıdır. İyonizan ışınların hücrelerde bulunan ve çok önemli görevlere sahip olan makro ve mikromoleküller üzerine olan olumsuz etkileri de çok fazladır. Biyolojik sistemlerde suyun fazla olması ve böyle ortamlardan iyonizan ışınların geçmesi suyun iyonizasyonuna da neden olur.
Bu reaksiyonda oluşan pozitif yüklü su iyonu, iyonize olmamış su molekülü ile reaksiyon vererek serbest hidroksil radikalleri oluşturur.
(2) H2O + H3O —›H3O + OH (serbest radikal)
Birinci reaksiyonda açığa çıkan elektron, iyonize olmamış su ile reaksiyon vererek serbest hidroksil radikallerine yol açar. Hidroksil radikallerinin çok kuvvetli oksidan etkisi olduğundan, DNA üzerinde zedelenmelere sebep olur. Hücrede, irradyasyon sırasında, oksijenin bulunması ışınların etkisini daha da arttırır. Serbest radikallerin oksijenle birleşmesi sonu bir seri otooksidatif reaksiyonlara ve ayrıca da peroksidase oluşumuna neden olur. Bunlar ışınların etkisini artırırlar. Buna karşılık hücre içinde bulunan sülfidril grupları da, biyolojik sistemlerin koruyucu olarak, irradyasyonun zararlarını hafifletirler.
İyonizan ışınlardan pratikte, sterilizasyon amacı ile yararlanılır. Gram pozitif ve negatif mikroorganizmalar üzerine letal etkileri fazladır ve bu tesir logaritmik bir kural içinde meydana gelir (belli zaman aralıklarında belli veya sabit düzeyde mikroorganizmalar ölürler). Öldürme olayı, ışınların dalga uzunluğu ve total radyasyon dozu ile bağıntılıdır.
4.2.2.6 Elektromagnetik İyonizan Radyasyonlar
*X-ışınları: Bu elektromagnetik ışınlar elektrik jeneratörleri tarafından oluşturulur. Dalga uzunlukları 10 A° ile 10–4 A° arasında değişir ve yüksek enerjiye sahiptirler. Bu nedenle mikroorganizmalara ve yüksek organizmalara etkilidirler. Elde edilmesi güç ve pahalı olduğu gibi çıkış yerinden her tarafa yayılma özelliğine de sahiptirler. Derinlere girebilme özellikleri bunların letal etkilerini artırır. Bu ışınlardan pratikte, mutasyonlar meydana getirmekte ve paketlenmiş gıdaları sterilize etmede yararlanmaktadır.
*Gama ışınları: Bu da elektromagnetik bir ışınım olup doğal veya yapay radyoaktif elementlerden elde edilirler. Bu amaç için kobalt-60 fazla kullanılır.
Yüksek enerjili olup dalga boyu, X-ışınlarından daha kısadır ve bu nedenle letal etkisi de daha fazladır. Her tarafa yayılma özelliği gösteren bu ışınlardan gıdaların sterilizasyonunda yararlanılır.
4.2.2.7 Partiküler Radyasyonlar
* Alfa ışınları: Radyoaktif elementlerden elde edilen çok hızlı ve yüksek enerjili bir helyum çekirdeğidir.
* Beta ışınları: Aynı tarzda, radyoaktif elementlerden elde edilen hızlı ve yüksek enerjili negatif yüklü bir ışınımdır.
* Katot ışınları: Elektrik akseleratörleri tarafından oluşturulan ve elektron demetleri halinde ışınlardır. Yüksek voltajlı ve vakumlu tüplerde katottan çıkarak anoda doğru hızla hareket ederler. Bu ışınlardan pratikte, sterilizasyon amacı ile sınırlı olarak yararlanılır.
4.2.3. Yüzey Geriliminin Etkisi
Besi yerlerinde bulunan gıda maddelerinin mikroorganizmalara girebilmesi, bakteri içinde sentezlenen enzimlerin ve oluşan metabolitlerin dışarı çıkabilmesi için, hücre duvarının yarı geçirgen özelliğinin önemi çok fazladır. Metabolizma olaylarının normal meydana gelebilmelerinde mikropların bulunduğu sıvı ile bakteri yüzeyi arasındaki moleküler gerilimin dengede bulunması gereklidir. Bu denge, bakteriye giriş-çıkışı büyük ölçüde kolaylaştırır.
Bakteriye temas eden sıvı yüzeyindeki moleküllerin oluşturduğu gerilim çok fazla olursa, oluşan kuvvetli moleküler membran nedeniyle, sıvı ortamdan bakteriye gıda maddelerinin girişi çok güç olur ve bakteri beslenemez. Aksine, bu moleküler gerilim zayıf olursa, sıvı ile bakteri yüzeyi birbirine çok sıkı temas ederek sıvı içindeki maddelerin bakteri yüzeyinde toplanmasına sebep olur. Buna bağlı olarak bakteri içinden dışarı ve dışardan içeri gıdaların akışı güçleşir ve bakteri yine beslenemez. Yukarıda bildirilen nedenlerle, bakteri yüzeyi ile buna temas eden sıvı ortamın yüzeysel moleküler gerilimin dengede bulunması zorunludur.
Yüzey gerilimi (interfascial gerilim) iki sıvı veya sıvı ile katı (sıvı besi yeri ile bakteri yüzeyi gibi) arasında olabileceği gibi sıvı ile hava arasında da olabilir.( kaynak 5 )*****
4.2.4. Ozmotik Basıncın Etkisi
Mikroorganizmalar belirli bir mekanizma ile hücre içinde ki ozmatik basıncını dengede tutarlar. Bu denge potasyum iyonunun (K+) aktif olarak hücre içine alınması ile ve hücre içi iyon dengesi de + elektrik yüklü bir organik madde olan putrescinenin dışarıya atılmasıyla sağlanır. Mikroorganizmanın bir çoğu optimal ozmatik basınçlı ortamlarda, bu ortamlarda ki ozmatik basınç sınırlı sapmalar gösterse de üreyebilirler. Ancak bazı mikroorganizmalar beslenip üreyebilmek için yüksek ozmatik basınçlı ortam gereksinirler. Yoğun tuzlu ortamda yaşamaya uymuş halofil ( deniz bakterileri v.b.) ve yüksek ozmatik ortamda (yoğun şekerli ortamlar ) yaşamaya uymuş ozmofil mikroorganizmaların ortamlarındaki ozmatik basınç ona göre ayarlanmalıdır. (kaynak 6 )******
Ozmosis, yarı geçirgen bir membranla ayrılan konsantrasyonları farklı olan iki sıvının bu zardan birbirine doğru geçişini ifade eder. Bu geçiş olayı her iki tarafın ozmotik basıncı veya yoğunluğu birbirine eşit olancaya kadar devam eder.
Eğer bakteri, %20 tuz konsantrasyonu içinde süspansiyon yapılırsa, hipertonik bir ortam oluşacağından, plasmoliz olayı meydana gelir. Bunun aksine, bazı bakteriler, %1 oranındaki tuz konsantrasyonu içinde süspansiyon yapılırlarsa, su akışı bu sefer dışardan içeri doğru olur ve bakteri şişerek parçalanır (plasmoptiz).
Bakteri içindeki ozmotik basınç, bakteri türlerine göre değişmek üzere, 5–20 atmosfer arasında bulunmaktadır. Bu basınca mikroplar hücre duvarı ile karşı koymaktadır. Bakteri içindeki bu fazla ozmotik basınç, içte bulunan organik maddeler (protein, amino asit, karbonhidrat, vs.) ve inorganik tuzlar tarafından oluşturulur.(kaynak 5 )*****
***** kaynak 5 : ( Temel mikrobiyoloji )
******kaynak 6: (Genel mikrobiyoloji ve bağışıklık bilimi)
4.2.5. Hidrostatik Basıncın Etkisi
Mikroorganizmalar hücre duvarının sert ve dayanıklı olması nedeniyle mekanik ve hidrostatik basınçlara karşı oldukça fazla direnç gösterirler. Çelik bir silindire konan ve süspansiyon halindeki mikroplar, burada oluşturulan fazla basınca, kendilerinde görülebilir önemli zararlı etkiler olmadan dayanabilirler. Okyanusların, denizlerin ve göllerin diplerinde bulunan barofilik mikroplar (B. submarineus, B. thalassokiotes) 10000 libre/inc2 (psu)’lik bir basınca kolayca dayanırlar ve bu basınç altında yaşamlarını sürdürürler. Ancak yüksek basınç altında mikroplarda, az da olsa, bazı değişmeler meydana gelebilmektedir. Örn. flagellalı mikroplar hareketlerini ve bazıları da bölünme kabiliyetini kaybedebilirler. Hidrostatik basınç 15000 psu olunca proteinlerde denatürasyon ve enzimlerde inaktivasyon görülebilir. Serratia marcescens ve S. lactis 85000–100000 psu basınç altında 10 dakika içinde ölürler.
4.2.6. Rutubetin ve Kurumanın Etkisi
Su, mikropların üremesinde, gıda maddelerinin içeri girişinde ve içeride biriken metabolitlerin ve diğer maddelerin dışarı çıkışında ve metabolik olaylarda çok önemli göreve sahiptir. Üreme ortamlarında bulunan gıda maddelerinin bakteriler tarafından alınabilmesi ancak bunların suda eriyebilir olmaları ile mümkündür ve su aracılığı ile de bakteriye girerler. Aynı şekilde, bakteri içindeki enzim veya metabolitlerin dışarı çıkabilmesinde de su önemli rol oynar. İçinde su oranı yüksek katı besi yerlerinde mikropların gelişmesi daha kolay olur ve oluşan koloniler daha iridirler. Mikropları üretmek için kullanılan etüvlerin havasının relatif rutubetinin de yukarıda bildirilen nedenlerle uygun olması gereklidir. Rutubetli etüvlerde, böylece, besi yerlerinin suyunun uçması ve besi yerlerinin kuruması önlenir ve mikroplar için gerekli nem sağlanmış olur. Sıvı besi yerlerinden suyun buharlaşması, bu besi yerinde bulunan kimyasal maddelerin konsantrasyonunu arttırır. Bu durum üreme üzerine olumsuz yönde etkiler. Katı besi yerlerinde üreyen mikropların beslenebilmesi için de agardan gıda maddelerinin diffusyonla bakterilere ulaşması lâzımdır. Bu görevi de yine su yapar.
Katı besi yerlerindeki suyun ve bunların konulduğu etüvlerin havasındaki rutubetin çok önemli olduğu bunun azlığı durumlarında bakteri üremesinin yavaşladığı ve durduğu görülür. Bu rutubet, katı besi yerlerinde beslenme üzerine etkili olduğu gibi mikroorganizmalardan suyun çıkması bakımından da önemlidir. Mikroorganizmalar içinde %70–90 kadar su bulunmaktadır. Bunun azalması birçok biyokimyasal olayların durmasına ve mikropların ölümüne sebep olur. Ancak, mikropların kurumaya karşı dirençleri değişiktir. Bazılarının (gonokok, meningokok, leptospira, pastörella. vs.) çok çabuk ölmesine karşın, bir kısım mikroorganizmalar da (stafilokoklar, E. coli, mikobakteriler, sporlar, mantarlar, vs.) daha dayanıklıdırlar. Sporların içinde %5–20 kadar suyun bulunması ve etraflarında kalın membranların oluşu bunları çeşitli fiziksel ve kimyasal etkenlere karşı çok dirençli hale getirmiştir.
Liyofilize edilen mikroorganizmalar uzun süre canlılıklarını korurlar. Liyofilizasyon sırasında uygulanan dondurma, kurutma ve havasını alma işlemleri sırasında bazı mikroplar ölebilirlerse de çoğu, uzun zaman canlı kalır ve infektivitesini korurlar.
4.2.7. Elektriğin Etkisi
Sıvı ortamlarda suspansiyon halinde bulunan mikroorganizmalardan direk veya alternatif elektrik cereyanı geçirilirse, mikroplar zarar görebilirler. Cereyanın şiddetli ve geçme süresi fazla olursa daha zararlı ve öldürücü olurlar. Elektrik nedeniyle sıvı ortamda bazı kimyasal değişmeler de meydana gelebilir. Oluşan sıcaklık ve elektroliz olayı sonu meydana gelen ara maddeler (klor, ozon, vs.) mikroplar üzerine zararlı etkide bulunurlar.
*Elektroforezis: Protein moleküllerinin veya mikroorganizmaların sıvı ortam içinde süspansiyonları yapılırsa, yüzeyleri pozitif (+) veya negatif (-) elektrikle yüklenirler. Böyle bir ortamdan uygun bir süre ve şiddette elektrik geçirilirse, pozitif yüklü olanlar katoda, negatif elektrikle yüklenmiş olanlar da anoda doğru hareket ederler (elektroforezis). Elektroforezisin birçok yöntemleri vardır. Bunların arasında kâğıt elektroforezis özellikle, pratikte, anormal serum proteinlerinin saptanmasında, serum ve sıvılardaki gama globülinlerin düzeylerini ölçülmesinde kullanılır. Jel elektroforezis yöntemi de daha ziyade proteinlerin nükleik asitlerin strüktürel durumlarını ortaya koymada veya analitik amaçlarla kullanılmaktadırlar.
4.3. Kimyasal Faktörler
Doğada serbest olarak yaşayan veya laboratuarlarda üretilen mikroorganizmalar üzerine etkileyen birçok kimyasal faktör bulunmaktadır. Bunların bazıları optimal koşullarda olduğunda üremeyi artırıcı etkilemesine karşın bu sınırların dışında ise üremeyi kısıtlayıcı, durdurucu ve hatta öldürücü etkide bulunurlar. Doğaldır ki, bu tarzdaki etkinlik dereceleri, kimyasal maddelerin yoğunluğu, yapısı ve etkileme süresi ile direkt ilişkili olduğu kadar mikroorganizmalara da bağımlıdır.
Mikropların üremelerinde etkili olan kimyasal faktörler arasında oksijen (O2), karbon dioksit (CO2), hidrojen iyon konsantrasyonu (pH), redoks potansiyel, ortama katılan bufferler yanı sıra hastalık oluşturan mikroorganizmaların üremelerini önlemek (stasis) veya öldürmek (sidal) amacı ile kullanılan antibiyotik, kemoterapötik maddeler ile çeşitli dezenfektanlar da bulunmaktadır. Bu son maddeler, özellikle, mikroorganizmaları kontrol altına almada kullanılırlar.
4.3.1. Oksijenin Etkisi
Mikroorganizmaların, üremeleri için oksijene olan ihtiyaçları, çok değişiklik göstermektedir. Bu gereksinmeye göre mikroplar 5 temel bölüme ayrılarak incelenebilirler. Yandaki şekilde sırasıyla aerobik, anaerobik, fakültatif, mikroaerofil, aerotolerant üreme şekilleri görülmektedir.
*Aerobik mikroorganizmalar: Üremeleri ve yaşamaları için havadaki oksijene ihtiyaç gösteren mikroplar, doğada diğerlerinden daha fazla bulunurlar. Bunlar havasız koşullar altında gelişemezler. Çünkü oksijensiz ortamlarda enerji elde edebilecek mekanizmaya sahip değillerdir. Dik agar besi yerlerinde üretildikleri zaman genellikle üst kısımda koloni oluştururlar. Tam aerobik mikroorganizmalar, havadaki moleküler oksijeni elektron alıcısı olarak kullanırlar. Bu tür mikropların enzim sistemleri, hidrojeni (H+), serbest oksijene (O2) transfer ederek hidrojen peroksit (H2O2) oluştururlar. Bu madde toksik olduğundan katalase enzimi tarafından hemen H2O ve O2’ye ayrıştırılır (H2O2 —› H2O + O2). Bazı mikroplar da H2O2’yi hidrojen (H) alıcısı olarak ta kullanılabilirler (H2O2 + 2 (H) —› 2 H2O).
Aerobik mikroorganizmaların üremeleri esnasında kültürlerin aerasyonu üreme üzerine olumlu yönde etki yapar. Aerobik mikroorganizmalar arasında, M. tuberculosis, B.anthracis, B. subtilis, sarcina, vs. sayılabilir.
**Fakültatif mikroorganizmalar: Bu gruba giren mikroplar hem aerobik ve hem de anaerobik koşullarda üreyebilme mekanizmasına (enzimatik sisteme) sahiptirler. Bunlar, oksijen içeren koşullarda aynı aerobik mikroplar gibi üremelerine devam ederler. Anaerobik şartlarda da redükte olabilen maddeleri (sülfür, karbon, sodyum nitrat, vs.) hidrojen alıcısı olarak kullanabilirler. Ancak, bu mikroorganizmalar daha fazla enerji sağlayan aerobik koşullarda daha iyi gelişirler. Anaerobik durumlarda, fakültatif mikroplar az bir fermantatif metabolizma gösterirler. Diğer bir deyimle, substratları tam olarak okside edemezler. Bu tür mikroplar (enterobakteriler, stafilokoklar, vs.) dik agarın her tarafında üreme yeteneğine sahiptirler.
*** Anaerobik mikroorganizmalar: Anaerobik mikroplar oksijenin bulunmadığı ortamlarda gelişebilirler. Oksijen bunlar için zehirleyici tesir yapar. Bunlarda bulunan enzimler oksijen tarafından bloke edildiği gibi, enzim sistemleri, hidrojeni (H+), oksijene transfer edemez ve başka oksijen alıcısı (nitrat, sülfat, karbonat, vs) kullanırlar. Bu nedenle, hücre içinde H2O2 oluşmaz. Bu maddeyi ayrıştıramadıklarından, kendileri için toksik etki yapar.
Bu tür mikroplar dik agar besi yerinin dip tarafında ürerler. Anaerobik mikroplar arasında, klostridiumlar, aktinomyces, Sphaerophorus necrophorus, v.s. sayılabilir.
****Mikroaerofilik mikroorganizmalar: Bu mikroplar havada bulunan orandaki kadar oksijen içeren ortamlarda gelişemeyip, oksijen oranı %1–2 kadar düşürülmüş veya havasına %5–10 CO2 katılmış yerlerde üreme olanağına sahiptirler. Bunlar anaerobik olmayıp böyle koşullarda da gelişemezler. Mikroaerofilik mikroorganizmalardan B. abortus, C. fetus, bazı mikoplasma türleri vs. sayılabilir. Bu tür mikroplar katı besi yerlerinin yüzeyinden 1–1,5 cm kadar aşağıda ürerler.
*****Aerotolerant mikroorganizmalar: Bu mikroorganizmalar daha fazla yüzeyde olmak üzere, hem aerobik ve hem de anaerobik ortamlarda üreme yeteneğine sahiptirler.
4.3.2. Redoks Potansiyelin Etkisi (Oksidasyon-Redüksiyon Potansiyeli)
Oksidasyon-redüksiyon (O-R) elektriksel bir olaydır ve elektron transferi üzerine dayanır. Oksidasyon (elektron kaybı) ve redüksiyon (elektron kazanma) fenomenleri genellikle birlikte cereyan ederler.
Bir madde okside olurken diğeri redükte olur. Elektron alıcısı okside eden, elektron vericisi de redükte eden ajandır. Elektronun bir maddeden diğerine geçişi iki madde (reaktant) arasında potansiyel farkını yaratır. Bu farkın şiddeti, kazanılan ve kaybedilen elektronlara bağlıdır. Bu da, maddenin oksidan veya redüktan oluşuyla ilgilidir. Eğer, madde çok fazla oksidan ise elektriksel potansiyeli (veya O-R potansiyeli) o oranda büyük olur ve pozitif değer taşır. Eğer redüktan madde ise, bu değer düşüktür ve negatiftir. Okside olan ile redükte olan maddelerin konsantrasyonu birbirine eşitse, O-R potansiyeli sıfır olur. Anaerobikler düşük bir O-R potansiyeline gereksinme duyarlar (0,2 volt). Aerobiklerde ise durum + 0,2–0,4 volt’tur.
4.3.3. Hidrojen İyon Konsantrasyonunun Etkisi (pH, Potansiyel Hidrojen)
Mikroorganizmaların üremeleri için, besi yerinin pH’sının optimal sınırlar içinde bulunması gereklidir. Minimal ve maksimal pH limitlerine yanaştıkça üreme azalır ve durur. Bakterilerin optimal pH limitleri oldukça değişiktir. Asit ortamı seven mikroorganizmalar (maya, küf, laktobasil, asetobakter, vs) yanı sıra, alkali besi yerlerinde üreyenler de (mikoplasma, toprak bakterileri, V. cholera, vs.) vardır. İnsan ve hayvanlarda hastalık oluşturanlar genellikle, konakçının sıvı ve dokularının pH derecesinde (pH. 7,0–7,4) ürerler. Patogenik mikroorganizmaların besi yerlerinde üreme pH limitleri, apatogenlerden daha dardır.
Ortamın pH’sının değişmesinde besi yerine katılan ve fermente olabilir karbonhidratların ayrışması sonu oluşan organik asitlerin, nitrojenli veya proteinli maddelerin dekompoze olması neticesinde meydana gelen amonyak veya alkalen maddelerinin önemi fazladır. Ayrıca, hücrede oluşan ve dışarı çıkan diğer metabolizma artıkları da pH’nın değişmesine büyük ölçüde etkilerler. Bazı mikroplar da reaksiyonu dönüştürebilirler. E. aerogenes glikozu ayrıştırarak asit yapar ve ortamın pH’sı düşer. Glikoz sarf edildikten sonra, bu sefer teşekkül eden, asit ürünler mikrop tarafından ayrıştırılır. Bu durumda besi yerinin pH’sı normaline doğru çıkış gösterir.
Üremeyi olumsuz yönde etkileyen pH değişmesini önlemek için, besi yerine buffer’ler katılır. Bu amaçla, genellikle, ayrı ayrı veya birlikte K2HPO4 veya KH2PO4 kullanılır. Bunlar meydana getiren hidrojen (H) ve hidroksil (OH) iyonlarının serbest kalmasının önüne geçer ve onlarla birleşikler oluşturur. Bu nedenle de, ortamın pH 'sı hemen asit veya alkali olmaz bir süre optimal limitler arasında kalır.
Bir besi yeri hazırlanırken pH'sı da mikroorganizmanın fizyolojik karakterine uygun olarak (optimal pH) ve genellikle %10–20 NaOH’la ayarlanır. Otoklavdan sonra 1–2 diziyem düşeceği hesap edilerek pH iyice saptanır. Bir sıvı ortamın pH’sını ölçmede ya elektrikle çalışan pH metreler veya daha az duyarlı olan kolorimetrik yöntemler kullanılır.
Bir ortamın pH’sı, içinde bulunan hidrojen iyonların konsantrasyonu ile ölçülür. Saf suyun litresinde, + 22 °C’de 10–7 gram hidrojen iyonu (H+) ile yine aynı miktarda (10–7 gram hidroksil iyonu (OH-) bulunur. Her iki iyon aynı konsantrasyonda bulunması nedeniyle saf suyun reaksiyonu nötrdür ve pH’sı 7,0 olarak kabul edilir.
4.4. Biyolojik Faktörler
Canlıların vücudunda özellikle, sindirim, solunum, urogenital sistemleri ile derilerinde değişik cinslere ait sayısız mikroorganizma (yerleşik devamlı mikroflora) bulunmaktadır. Bunlar birbirleri ile ekolojik bir denge içinde, birbirlerinin üremelerini sınırlayarak yaşamaktadırlar. Sentezledikleri veya salgıladıkları substanlar karşılıklı etkileyerek birbirlerinin üremelerine ve hatta ölmelerine de yol açarlar. Aynı zamanda, bu yerleşik flora bazı patojenik mikroorganizmaların kolonizasyonuna da mani olur. Eğer bu metabolitleri sentezleyen mikroorganizmalardan biri veya ikisi ortadan kaldırılırsa, diğerinin fazla üremelerine ve bazı durumlarda hastalık yapmalarına da neden olur. Özellikle antibiyotiklere duyarlı olmayan mikroorganizmalar C. albicans veya C. difficile infeksiyonlar oluşturabilirler.
Sindirim sistemi florasında bulunan, E. coli 'nin sentezlediği colicin (bakteriyosinler), bu maddeyi sentezlemeyen E. coli’ler üzerine öldürücü etkide bulunur. Eğer bakteriyosin sentezleyen E. coli’ler antibiyotik tedavileri sonunda çok azalırlarsa, diğer E. coli’ler çoğalma fırsatı bulurlar.
Böylece, sindirim, solunum, urogenital ve deride bulunan mikroflora birbirleri ile çok hassas bir denge içinde bulunurlar ve sentezledikleri antagonist etkiye sahip metabolitlerle birbirlerinin üremelerini kontrol altında tutarlar.
Vücudun çeşitli sistemlerinde (sindirim, solunum, urogenital) ve diğer bölgelerin de (oral ve deri de) bulunan yerleşik mikroflora aynı zamanda karşılıklı bir ortak yaşam içinde de bulunurlar.
4.5. Mekanik Faktörler
4.5.1. Çalkalamanın Etkisi
Bu faktörler laboratuarlarda mikroorganizmaların, özellikle, hareketsiz olanlarının veya zayıf üreme gösterenlerin üremelerini ajite etmek ve bulunduğu ortamlardan daha elverişli yerlere ulaşmasını sağlamak amacı ile uygulanmaktadır.
Laboratuarlarda kültürlerin çalkalanması genellikle çok hafif olmakta (dakikada 10–20 devir) ve üreme üzerine olumlu etkide bulunmaktadır.
Eğer çalkalama çok hızlı veya sert olursa mikroorganizmalarda ölümler meydana gelebilir.
4.5.2. Filtrasyon
Sıvı kültürlerde, sıvı besi yerinde, patolojik sıvılarda, serumlardaki, bakterileri ve partikülleri gidermede filtrelerden fazla yararlanılır. Bu amaçla, bakterileri tutan ve delik çapları belli olan özel filtreler kullanılır. Bakteri geçirmeyen filtrelerin delik çapı 1 mikrometreyi (µm) aşmamalıdır.
Bakteri alıkoyan filtreler yapısını oluşturan maddelere göre başlıca 5 kısma ayrılırlar.
*Seitz filtreleri: Bu tür filtreler asbest den yapılmış diskler halindedirler. Delik çaplarına göre birçok türleri vardır. Bakterileri tutan EK (entkeimung) ve sıvıları berraklaştıran (K) gibi fitrelerden mikrobiyoloji laboratuarında, gereğine göre, önce (K) sonra da (EK) tipleri kullanılabilir. Seitz filtreleri komple olarak etrafı gümüşle kaplı veya paslanmaz çelikten yapılmış özel metal parçadan ve bir de metal elekten oluşur. Otoklavda sterilize edildikten sonra kullanılır. Asbest filtre de bu metal parçalardaki elek üzerine monte edilir.
Seitz filtrelerin sıvıları absorbe özelliği yanı sıra bazı toksik maddeleri de sıvıya verme durumları da vardır. Bu nedenle, filtrasyondan önce, filtreden steril distile su geçirilerek yıkanır ve olumsuz etkileri giderilir. Sonra, bu süzüntü çekilerek alınır ve sonra süzülmek istenen sıvı süzülür. Kullanıldıktan sonra asbest diskler atılır. Seitz filtrelerinin çok eski bir tarihi olmasına karşın bu günde hala kullanan yerler vardır.
** Berkefeld filtreleri: Bu tür filtreler fosil diatome toprağından yapılmıştır. Sıvıları emme kabiliyeti fazladır. Delik çapları çok değişik olarak imal edilir. Başlıca 3 tür porositeye sahiptir, kaba (V), normal (N) ve ince (W). Bu nedenle, en çok (W) tipi kullanılır ve bu mikropları geçirmez.
Bu tür filtreler kullanmadan önce sterilize edilirler. Kullanıldıktan sonra çok ince fırça ile temizlenir ve suda kaynatılırlar. Sonra, dıştan içeri su geçirmek suretiyle temizlenirler. Filtreler, kurutulur ve tekrar sterilize edilerek kullanılırlar.
Eğer organik madde ile tıkanıklık, meydana gelmişse filtre fırında yakılarak bu tıkanıklık giderilir. Tarihsel değeri vardır. Bugün kullanılmamaktadır.
*** Chamberland filtreleri: Bu filtre türü sırsız porselenden yapılmıştır ve çeşitli porositeye sahiptir. Bu özelliğine göre L1a, L2 ve L3 tipleri, Berkefeld filtrelerinin (V) (N) ve (W) bujilerinin eşdeğerdedir. Kullanıldıktan sonra temizlenir, kurutulur ve otoklavda sterilize edilir. Tarihsel değeri vardır.
****Cam tozu filtreleri: Cam tozlarının bir araya getirilip birleştirilmesinden oluşan cam filtreler de porositelerine göre E (çok kaba), C (kaba), M (orta) F (ince), UF (çok ince) olarak yapılmıştır. Laboratuarlarda çeşitli amaçlar için kullanılır. Ancak, özel bir filtrasyon aparatına monte edilerek otoklavda sterilize edilirler. Kullanıldıktan sonra akan su ile ters yönde yıkanır. Lüzum halinde, KNO3 ihtiva eden sıcak H2SO4 solüsyonu, filtreyi temizlemek için kullanılır. Sülfürik asit + bikromat karışımı kullanılmaz. Bugün çok nadiren kullanılmaktadır.
***** Sellüloz membran filtreler: Başlıca iki tür sellüloz membran filtre vardır. Biri eski tip olan sellüloz nitrat (gradokol membran) diğeri de yeni veya modern tip olan sellüloz asetat filtreleridir. Gradokol membranlar, çeşitli porositede (3 nm–10 nm) yapılabilir. Genellikle virusların büyüklüğünü ölçmede kullanılırlar. Milipor filtreler de aynı şekilde delik çapları değişik büyüklükte (8µm–0.01 µ) hazırlanmaktadırlar.
Sellüloz asetat filtreler de iki tabaka vardır. Basal tabakada 3–5 µm ve üst tabakada 0,1–1,0 µm çapında porosite bulunur. Bu nedenle bakteriler üst tabakada tutulurlar.
Otoklava (121 °C) 35–45 dakika dayanabilirler. Filtre disklerinin çapları 1,7–14 cm kadar olabilir. Özel metal veya cam tutucularda muhafaza edilirler.
Sellüloz filtrelerin, absorbsiyon kabiliyetinin daha az olması nedeniyle, Seitz filtrelerine tercih edilirler. Ayrıca daha hızlı süzme kapasitesi de vardır. Bakteri üst yüzeyde tutulduğu için de, bir agarın üzerine yatırılarak ekilebilirler.
Filtrasyonda, filtrelerin özelliğine göre, negatif veya pozitif basınç kullanılır.
4.5.3. Santrifugasyon
Normal laboratuar santrifüjleri ile bir sıvı içindeki mikropları gidermek pratik olarak mümkün değildir. Yüksek devirli santrifüjlerle hem bakteriler ve hem de viruslar çökebilirler. Ancak, bu çökme işlemi viruslar ve bakteriler için %100 kabul edilemez. Özellikle, sıvı içinde fazlaca virus kalabilir. Bu sebeple santrifüj yardımıyla bütün mikroorganizmalar giderilemezler veya sıvı steril hale getirilemez.
4.5.4.Ezmek
Santrifüj yardımıyla çöktürülen mikroplar bir havana veya ezme aletine konur burada ezilerek parçalanabilir. Bu yöntemle de bütün mikroplar ölmezler.
4.5.5. Basınç Uygulamak
Devamlı ve yüksek basınç altında bazı mikroplar ölebilirler. Ancak hepsi ölmez.
4.5.6. Çalkalamak
Mikropların sertçe ve devamlı çalkalanması bazılarının ölümüne neden olabilir. Fakat büyük bir kısmı canlı kalabilir.
4.5.7.Vibrasyon
Suspansiyon halindeki mikroplar ultrasonik vibrasyonlara maruz bırakılırsa ölebilirler. Bu, tam anlamıyla sterilizasyon sağlamaz
kendı arkadaşımın yapmış olduğu bır odev...